Xanthomonas citri subsp. Citri, causal agentof citrus bacterial canker: isolation andmolecular detection methods, evaluation ofsurvival in fruits
- Autores: Morteza GolMohammadi
- Directores de la Tesis: María Milagros López González (dir. tes.), Pablo Llop Pérez (codir. tes.), Jaime Cubero (codir. tes.), María Isabel Font San Ambrosio (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat Politècnica de València ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Emilio Montesinos Seguí (presid.), Concepción Jordá Gutiérrez (secret.), Edson Bertolini (voc.), Ester Marco Noales (voc.), Jesús Murillo Martínez (voc.)
- Materias:
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- Resumen
La cancrosis de los cítricos, causada por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), es una de las enfermedades bacterianas más graves que afecta a este cultivo. Se caracteriza por lesiones eruptivas en las hojas, frutos y ramas y por la disminución de la calidad y la producción de los frutos. Esta enfermedad no se ha detectado en ningún país de la Unión Europea (UE) donde Xcc está considerada como un organismo de cuarentena según la normativa vigente. La importación de frutos con síntomas, si se confirma que han sido producidos por Xcc, está siempre prohibida a pesar de los tratamientos aplicados y lleva al rechazo del lote. Según la legislación de la UE, en todos los países europeos se deben analizar las muestras de frutos importados con síntomas sospechosos, cuando se importan de áreas donde está presente esta enfermedad. Se habían propuesto varios protocolos para la detección rutinaria del agente causal de la cancrosis, pero hasta el momento no se había realizado un estudio sobre la detección de X. a. citri en frutos comerciales importados. En esta tesis doctoral, en primer lugar se ha estudiado la aplicación de una metodología de detección que combina el aislamiento bacteriano en medio de cultivo con métodos basados en PCR convencional y a tiempo real. Para ello, se comparó la eficacia del aislamiento de la bacteria, seguido del análisis de la patogenicidad en hoja de pomelo, de tres protocolos convencionales de PCR y dos protocolos de PCR a tiempo real (con SYBR Green y con sonda TaqMan). Estos métodos se han empleado para analizar frutos con síntomas de cancrosis, importados a España en los últimos años de varios países sudamericanos donde está presente esta enfermedad (Argentina, Uruguay, Brasil y México). El análisis de los datos obtenidos nos ha mostrado que una estrategia de detección que incluya diversas técnicas parece más apropiada para evitar falsos positivos y falsos negativos y introducción de esta bacteria en la UE. Por otra parte, la técnica de PCR en tiempo real se ha mostrado como la más sensible y se propone como técnica inicial en el análisis de los frutos importados.
En la segunda parte de la tesis se ha evaluado el uso de distintos mRNAs y rRNAs, como marcadores de viabilidad para su aplicación en estudios de de la supervivencia bacteriana de Xcc con el fin de ser utilizados en estudios epidemiológicos y de control de la enfermedad, así como su posible uso en los protocolos de diagnóstico rutinario. Para ello, el ARN total de bacterias sometidas a diferentes tratamientos bactericidas (alta temperatura y tratamiento con orthofenilfenato sódico) fue extraído a diferentes períodos de tiempo después de los tratamientos y analizado por retrotranscripción-PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR ) utilizando iniciadores diseñados a partir de genes del rRNA y del mRNA. De todos los fragmentos de ARN estudiados, únicamente el mRNA (480 pb) correspondiente al gen gumD fue detectado específicamente en las células vivas de Xcc, mientras que otros fragmentos de ARN fueron detectados tanto en células vivas como muertas. Un análisis detallado de la variación en los ciclos umbrales de fluorescencia (Ct), así como un estudio de cuantificación relativa siguiendo el método del ¿¿Ct demostró que además del fragmento de 480 pb descrito más arriba, las concentraciones de otros fragmentos de ARN de genes implicados en la síntesis de xantano y del procesamiento de ADN sufrieron variaciones significativas después de los tratamientos bactericidas. Por lo tanto, el fragmento secuenciado de ARNm del gene gumD (480 pb) es un marcador útil para la determinación de células viables de Xcc, además los niveles de concentración de otros ARNs, pueden ser utilizados como parámetros de viabilidad.
En la tercera parte de la tesis se ha ensayado otro método con interés potencial para la detección de células viables. En este estudio hemos desarrollado un protocolo basado en NASBA (amplificación isoterma) para la detección de secuencias específicas del genoma de Xcc con tres parejas de iniciadores diseñados sobre la base del gene 16S rRNA y del gene gumD de la cepa Xcc 306. las suspensiones de la bacteria fueron sometidas a diferentes tratamientos térmicos y químicos que incluían una elevada concentración de ortofenilfenato sódico, con el fin de evaluar la metodología así como la eficacia de estos métodos de control. El análisis NASBA puso de manifiesto la eficacia del ortofenilfenilfenato sódio como compuesto bactericida para eliminar la posibilidad de inóculo de Xcc in vitro de muestras y una vez más el fragmento de ARNm del gen gumD gen se mostró como un buen marcador para la detección de bacterias viables.
En la última parte de la tesis se ha estudiado la supervivencia de Xcc en condiciones de estrés. Se ha evaluado el comportamiento de la bacteria frente a diferentes concentraciones del sulfato de cobre en medio mínimo a una temperatura optima para Xcc,. Se ha demostrado que el cobre induce el estado viable no cultivable (VBNC) en esta bacteria, que es una estrategia de supervivencia de varias especies de bacterias patógenas. Las células que entran en el estado VBNC se han podido recuperar al estado cultivable y su poder patógeno, se ha reproducido en hoja de pomelo. Algunas características de estas células en estado VBNC, como la integridad de sus membranas o la presencia de determinados secuencias de ARN se ha estudiado en ellas. Los estudios realizados, contribuyen a mejorar los protocolos de diagnósticos de Xcc en frutos cítricos y el conocimiento de la biología de esta bacteria en los mismos.
