Exploring the regulatory mechanisms of the s. Cerevisiae ppz1 protein phosphatase and the molecular basis for its toxicity
- Autores: Diego Velázquez Sánchez
- Directores de la Tesis: Joaquín Ariño Carmona (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ethelvina Queralt Badía (presid.), José Ramon Bayascas Ramírez (secret.), Asier González (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Autónoma de Barcelona
- Materias:
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- Resumen
Uno de los más notables componentes en la homeostasis de cationes en levaduras es la proteína fosfatasa Ppz1. El papel de Ppz1 es doble: por un lado, inhibe la entrada de potasio mediante el control de la actividad de los transportadores Trk1 y Trk2 y, por otro lado, atenúa la expresión del gen de la Na+-ATPasa ENA1. Ppz1, a su vez, está controlada negativamente por dos subunidades reguladoras estructuralmente relacionadas, Hal3 y Vhs3, siendo la primera la más relevante funcionalmente. A parte de esto se ha demostrado hace tiempo que niveles altos de Ppz1 son extremadamente perjudiciales para la célula.
El primer objetivo de este trabajo ha sido estudiar la interacción entre Ppz1 y Hal3. A pesar de las numerosas evidencias de que ambas proteínas interaccionan físicamente, se desconoce las regiones de cada proteína que están involucradas en dicha interacción y hasta qué punto es un proceso dinámico. Para ello se han diseñado dos aproximaciones experimentales, por un lado se han creado una serie de cepas con etiquetas fluorescentes en Ppz1 y Hal3, para seguir su interacción in vivo gracias al fenómeno de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) mediante citometría de flujo. Estas fusiones de Hal3 y Ppz1 con proteínas fluorescentes, además de ser completamente funcionales, han demostrado la interacción in vivo de ambas proteínas y permiten estudiar posibles variaciones en la interacción. Por otro lado, mediante experimentos de crosslinking in vitro de ambas proteínas y un posterior análisis por LC-MS/MS se han mostrado dos regiones del dominio C-terminal de Ppz1 y tres regiones de Hal3, que podrían ser las responsables de llevar a cabo esta interacción.
Si bien Ppz1 es regulada negativamente por Hal3 y Vhs3, es evidente que la región más N-terminal de Ppz1 es muy rica en residuos fosforilables. De hecho, el 30% de este dominio son serinas o treoninas, y algunas de ellas han sido identificadas como fosforiladas en diversos estudios. Sin embargo, apenas ha sido estudiado que efectos funcionales pueden dar lugar cambios en el estado de fosforilación de Ppz1. En este trabajo hemos conseguido demostrar que la MAPK Hog1 fosforila a Ppz1 en la posición S265, pero este hecho no es suficiente para alterar el comportamiento de la fosfatasa. Además, hemos conseguido demostrar que el estado de fosforilación de Ppz1 puede variar dependiendo de factores externos como alta concentración de sal o deficiencia de potasio.
Se ha demostrado que Ppz1 es la proteína más tóxica de levadura cuando se sobredosifica. Recientemente, en nuestro laboratorio se ha verificado que la actividad fosfatasa de Ppz1 es necesaria para causar dicha toxicidad, ya que la sobreexpresión de una versión catalíticamente inactiva no causa problemas de crecimiento en las células. Sin embargo, las bases moleculares de esta toxicidad son desconocidas. En nuestro caso hemos realizado experimentos para conocer el estado del proteoma y del fosfoproteoma de S. cerevisiae cuando se sobreexpresa Ppz1, y hemos descrito una variación en el estado de fosforilación en numerosas proteínas de la levadura. De hecho se han identificado cambios importantes en proteínas relacionadas con la traducción, polarización celular, la transición G1/S del ciclo celular o con el metabolismo de carbohidratos. Además, algunos experimentos paralelos han reforzado los resultados obtenidos mediante espectrometría de masas, como la defosforilación de Mig1 y Rps6, o una hiperfosforilación de eIF2α en la Ser-51, indicando una posible inhibición en la iniciación de la traducción.
En resumen los resultados obtenidos en esta tesis han puesto a punto herramientas para conocer más sobre el dinamismo de la interacción Ppz1-Hal3, han aportado datos sobre la fosforilación de Ppz1, y han generado una gran cantidad de datos de fosfoproteómica cuyo estudio detallado podría llevar a esclarecer bases moleculares de la toxicidad de Ppz1 en S. cerevisiae.
