Resumen de Neuronal differentiation and maturation of human pluripotent stem cells for modeling huntington's desease
La enfermedad de Huntington es un trastorno neurodegenerativo autosómico dominante causado por una expansión CAG (> 35-40) del gen de la huntingtina. Esta mutación conduce a una proteína htt mutada con funciones e interacciones alteradas. A pesar de que la proteína htt se expresa ubicuamente en todas las células del cuerpo, las neuronas espinosas medianas o MSNs (“médium spiny neurons”) del cuerpo estriado son las más vulnerables en la enfermedad de Huntington. La degeneración de estas neuronas causa alteraciones motoras y cognitivas cuya gravedad depende de CAG. La proteína Htt se expresa desde la fertilización hasta la adultez en diferentes compartimentos celulares y está involucrada en una amplia gama de funciones. Varias evidencias apuntan a la enfermedad de Huntington como un trastorno del neurodesarrollo con un inicio temprano durante la neurogènesis y el desarrollo estriatal. En la presente tesis estudiamos el mecanismo subyacente al desarrollo neuronal en la enfermedad de Huntington mediante el modelado de la diferenciación y la maduración de las células madre pluripotentes humanas (hPSC) a neuronas maduras y funcionales.
La capacidad de auto-renovarse y diferenciarse a otros tipos de células del cuerpo hace que las hPSC sean una poderosa herramienta para el estudio y tratamiento de trastornos neurodegenerativos, ya que podrían reemplazar la pérdida de neuronas degeneradas. Sin embargo, se requiere un protocolo preciso que imite el desarrollo endógeno para dirigir hPSCs en neuronas específicas. En el presente trabajo, hemos realizado una descripción detallada de la progresión de la diferenciación neuronal de células madre pluripotentes control y con de la enfermedad de Huntington desde la etapa de pluripotencia hacia neuronas maduras y funcionales del cerebro anterior. Con este fin, nuestro protocolo de diferenciación neuronal emplea morfógenos específicos, factores tróficos y de crecimiento, elementos de la matriz extracelular, iones y neurotransmisores durante ventanas de tiempo específicas. Mostramos que tanto las líneas hPSC control como de la enfermedad de Huntington muestran una progresión adecuada de la diferenciación neuronal y generan neuronas maduras después de 37 días in vitro (DIV).
También hemos puesto énfasis en caracterizar la maduración neuronal de las neuronas derivadas de hPSC. Hemos evaluado la maduración neuronal mediante el análisis de una amplia batería de proteínas sinápticas, neurotransmisores y canales iónicos mediante el análisis de expresión génica cuantitativa de alto rendimiento y / o ensayos de expresión proteica. Nuestros resultados muestran que los progenitores neurales derivadas de hPSC generados a DIV 12-16 incrementan la expresión de genes telencefálicos que incluyen los genes estriatales ASCL1, GSX1 / 2, DLX1 / 2 y EBF1. A DIV 16, los cultivos están compuestos en su mayoría por progenitores subpaliales (DLX+ y EBF1+) junto con progenitores paliales (PAX6+). La subsiguiente diferenciación de los progenitores neurales produce cerca del 100% de neuronas MAP2B + a 23 DIV. Estos cultivos neuronales contienen neuronas GABA+, CTIP2+ y TH+ junto con una subpoblación de neuronas glutamatérgicas TBR1 + y MSNs (CTIP2+ / DARPP-32+). Las neuronas muestran un fenotipo maduro ya que expresan marcadores sinápticos, canales iónicos dependientes de voltaje y receptores de neurotransmisores. Además, evaluamos la maduración funcional y la excitabilidad de las neuronas derivadas de hPSC mediante imágenes de calcio y NETCAL, un software personalizado de MATLAB. Extrajimos a cada neurona por individual un conjunto de características neuronales con el fin de definir y caracterizar de forma semiautomática la actividad espontánea de los cultivos neuronales. El análisis funcional a DIV 37reveló una alta proporción (84%) de neuronas con actividad espontánea que se dividen en 3 grupos principales: neuronas de actividad alta, intermedia y baja actividad en función de su patrón de actividad espontánea. Además, mostramos que las neuronas derivadas de hPSC aumentan progresivamente su excitabilidad a lo largo de la diferenciación neuronal. Las neuronas derivadas de hPSC a DIV 30 muestran una respuesta más alta y rápidas a estímulos despolarizantes en comparación con las neuronas a DIV18. Además, las neuronas a DIV 30 expresaban receptores NMDA funcionales. Por lo tanto, en la presente tesis describimos una herramienta personalizada y novedosa útil para caracterizar funcionalmente la actividad de las neuronas, la respuesta dependiente de fármacos y estudiar las conexiones neuronales. También, en la presente tesis, hemos utilizamos estimulaciones optogenèticas despolarizantes para promover y sincronizar la salida del ciclo celular y la diferenciación de los progenitores neurales derivados de hPSC. Mostramos que las estimulaciones aplicadas no son lo suficientemente robustas como para modular la diferenciación neuronal de los progenitores derivados de hPSC ya que no detectamos diferencias en los marcadores proliferativos en comparación con los cultivos no estimulados.
Además, también evaluamos la diferenciación, integración y maduración de hPSC en el entorno in vivo mediante el trasplante de progenitores neurales derivadas de hPSC en el estriado de ratones neonatales. Obtuvimos una alta supervivencia celular a largo plazo de células humanas trasplantadas en el cuerpo estriado del ratón. Las células progenitoras neurales se integran en el entorno del ratón y se diferencian a neuronas estriatales. Además, estas neuronas estriatales derivadas de hPSC se integran en los circuitos del huésped al proyectar hacia el Globus Pallidus. Estos resultados exitosos podrían ser útiles para estudiar el crecimiento y la proyección de axones, así como también para usar progenitor estriatales en terapias basadas en células para la medicina regenerativa para tratar la enfermedad de Huntington.
La diferenciación de hPSC derivadas de pacientes con la enfermedad de Huntington muestra alteraciones a lo largo de las diferentes etapas de la diferenciación neuronal in vitro en comparación con las líneas hPSC control. Nuestros resultados sugieren que la enfermedad de Huntington podría ser un trastorno del desarrollo ya que las hPSC con la enfermedad de Huntington muestran una aberrante proliferación y maduración neuronal.
En conclusión, hemos descrito la diferenciación y maduración neuronal de hPSCs control y con la enfermedad de Huntington hacia neuronas maduras y funcionales. También hemos diseñado herramientas novedosas y útiles para la caracterización funcional de la actividad neuronal y las respuestas despolarizantes de fármacos, así como hemos manifestado un buen modelo humano que podría utilizarse en terapias basadas en células para tratar trastornos neurodegenerativos.
