Papel de p21 en la regulación de la vía de wnt y su posible implicación en la neurogénesis
- Autores: Laura Sin Diaz
- Directores de la Tesis: Oriol Bachs Valldeneu (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2018
- Idioma: español
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
El planteamiento inicial de esta tesis doctoral ha sido identificar genes cuya expresión pudiera ser regulada por la proteína p21 (Cipl) para posteriormente profundizar en el mecanismo de regulación de alguno de estos genes. Para ello se realizaron estudios de inmunoprecipitación de cromatina con anti-p21 y posterior secuenciación del DNA asociado a p21 (ChlP-seq). Los estudios de ChlP-seq en células madre neurales han revelado que uno de los programas transcripcionales posiblemente regulados por la proteína p21 es la vía de Wnt. Esta es una vía de señalización celular muy conservada a lo largo de la escala filogenética y juega un papel decisivo en los procesos de diferenciación, proliferación y muerte celular. Mediante ChlP-seq y su posterior validación mediante ChlP se ha observado que la proteína p21 se une a una región de la cromatina situada a -3382 pb del inicio de transcripción del gen Prickle2, implicado en la vía de Wnt, pudiendo resultar en una regulación de Prickle2 mediada por p21.
La proteína p21 no se une directamente al DNA, por lo cual su unión a esta región debía ser a través de otro regulador transcripcional. Así pues, se planteó la posibilidad de que p21 pudiera unirse a través de E2F4, un represor transcripcional que forma complejos con p130 y otros ca-represores. Esta posibilidad nace de la observación de que, de manera similar a p27, p21 también se une a E2F4 y a p130. Se ha analizado esta posibilidad mediante ChlP con anticuerpos anti-E2F4, anti-p27 y anti-p130. Los resultados indican que efectivamente estas tres proteínas también se unen a esta región proximal al gen Prickle2 por lo que faltaba analizar si p21 estaba actuando o no como un represor transcripcional de Prickle2, siguiendo este modelo.
Con el objetivo de analizar si p21 estaba actuando como represor transcripcional, analizamos la expresión de Prickle2 en células a las que se disminuyeron los niveles de p21 mediante la utilización de shRNAs específicos contra p21. Los resultados obtenidos revelaron que en aquellas células C17.2 en las que se había silenciado p21, los niveles de expresión de Prickle 2 tanto a nivel de proteína como de RNA disminuían. Se decidió también analizar los niveles de Prickle 2 en células MEF "knock out" de p21 (KOp21). En estas células se obtuvieron los mismos resultados que en las Cl7.2, indicando que p21 actuaba como un activador de la transcripción de Prickle 2 y por lo tanto su disminución inducia la reducción la expresión de este gen.
Para profundizar un poco más en el mecanismo de esta regulación, decidimos analizar que pasaba con la expresión de este gen en células con deficiencias de las otras proteínas que forman parte del complejo regulador unido a p21. Para ello se evaluaron los niveles de proteína de Prickle2 en células C17.2 con niveles reducidos de E2F4 y en células MEF KOp27 y MEF KOp130. Tal y como se esperaba ocurría lo mismo que con p21, es decir, la desaparición o disminución de estas proteínas, resultaban en una bajada notable en la expresión de Prickle2 a nivel de proteína y de su mRNA. Por otro lado, se hicieron ensayos con el enfoque contrario, es decir se analizaron los niveles de Prickle 2 en células que sobre-expresaban p21. Específicamente, estos estudios se hicieron en células KMT con capacidad de inducir la expresión de p21, añadiendo ZnS al medio de cultivo. En estas células se observó que al incrementar p21, se inducia un incremento de la expresión de Prickle 2. Por lo tanto, se confirmaba que p21 actuaba como activador de la transcripción de Prickle 2. Por último, esta regulación se confirmó mediante el estudio de la expresión de Prickle 2 en clones de células C17.2 deficientes en p21 obtenidos utilizando la metodología CRISP/cas9 Nickasa.
Otra evidencia por la que p21 estaría regulando positivamente a Prickle2 viene dada por los resultados obtenidos en un microarray de expresión en MEFs KOp27 vs MEFs wt en nuestro laboratorio. Al obtener estos resultados decidimos indagar si Prickle2 resultaba como un gen también regulado por p27 y de qué manera. Los resultados fueron muy satisfactorios ya que Prickle2 aparecía como un gen down regulado en estas células KOp27, con unfold change de 2.10 y un p-valor de 3.30E-03.
Quedando demostrada esta relación positiva entre p21 y Prickle2, nos planteamos el diseño de un nuevo modelo de regulación, en el cual el complejo represor formado por p21 o p27, ciclinas-cdks, E2F4 y p130, estaría permitiendo la transcripción de Prickle2. En este modelo, este complejo estaría bloqueando una región represora del gen Prickle2, permitiendo así la unión del complejo activador a la cromatina induciendo así, la transcripción del gen.
Por otro lado, dos formas de Prickle han sido identificadas, Pricklel y Prickle2-EStªs proteínas son expresadas de diferente manera ya que Prickle 1 se encuentra en el corazón fetal y en tumores hematológicos, mientras Prickle2 está expresado en cerebro fetal, cartílago adulto, islotes pancreáticos y algunos tipos de células tumorales. Prickle contiene un dominio PET N-terminal y tres dominios LIM en posición e-terminal. Estos dos motivos zinc finger contienen ocho residuos conservados, mayormente cisteínas e histidinas, que coordinan la unión a los átomos de zinc. La función de los dominios LIM es la de adaptadores o andamios para soportar el ensamblaje de complejos proteicos. El primer dominio LIM de Prickle se encarga de la interacción con el represor neuronal Rest. Además de Rest se ha demostrado que Prickle interactúa físicamente con Smurfl y Oishevelled (Dsh). Diferentes estudios han demostrado que Prickle estaría regulando negativamente Dsh, Frizzled y Strabismus ubiquitinizándolos para ser degradados en el proteasoma. Esto implica que de hecho, que Prickle 2, junto a otras proteínas, está regulando negativamente la vía canónica de Wnt y promoviendo la vía no canónica. A su vez, varios estudios han implicado a la vía de señalización Wnt como regulador positivo de Rest. Ya que Rest es un represor neural y Prickle regula negativamente la vía de Wnt se deduce que p21 estaría implicado en la neurogénesis.
Tras la determinación de esta red de relaciones entre p21, Prickle2, vía de Wnt Y Rest y dado que la diferenciación celular se caracteriza con frecuencia por la detención del ciclo celular en Gl, asumimos que p21 ha de incrementar como una respuesta inmediata a los inductores de diferenciación.
Todo esto nos llevó a investigar la posible relación entre p21 y Rest, es decír, una regulación de Rest por parte de p21. Para ello se llevaron a cabo ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (Chf P} con anti-p21 frente al promotor de Rest para analizar si efectivamente p21 se unía al promotor de Rest. Posteriormente, se estudiaron los niveles de Rest en células deficientes en p21. Específicamente, se llevaron a cabo análisis de expresión génica mediante PCRs en clones c17.2 KOp21. En estos clones, el déficit de p21 resultó en un aumento de Rest lo que cabría pensar que p21 estaría actuando como un represor transcripcional. Además se evaluaron tos niveles de proteína en células diferenciadas a neuronas frente a las que no, Y tos resultados fueron muy relevantes ya que aquellos clones diferenciados tuvieron unél alta expresión de niveles de p21 a diferencia de Rest, y al revés aquellos con fenotipo no diferenciado presentaron niveles de p21 bajos y niveles de Rest elevados.
