Eicosanoides y estrés oxidativo en el neocórtex de pacientes con epilepsia resistente a fármacos, tr atados mediante cirugía de la epilepsia
- Autores: Jordi Rumiá Arboix
- Directores de la Tesis: Ferrer Rodriguez Enric (dir. tes.), Frederic Mármol Carrera (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Pedro Roldán Badía (presid.), Joaquim Enseñat Nora (secret.), Julio Albisua Sánchez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina e Investigación Traslacional por la Universidad de Barcelona
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
EICOSANOIDES Y ESTRÉS OXIDATIVO EN EL NEOCÓRTEX DE PACIENTES CON EPILEPSIA RESISTENTE A FÁRMACOS TRATADOS MEDIANTE CIRUGÍA DE EPILEPSIA.
1. Introducción La epilepsia es un trastorno neurológico grave que se caracteriza por la recurrencia de crisis epilépticas no provocadas, a menudo con efectos devastadores en los pacientes y su entorno. La generación de dichas crisis se relaciona con una situación anómala de hiperexcitabilidad e hipersincronía neuronales que desemboca en descargas eléctricas paroxísticas y en un daño cerebral potencialmente irreversible.
La epilepsia es la enfermedad neurológica crónica más frecuente que afecta a todos los grupos de edad, con más de 65 millones de pacientes en todo el mundo. Del total de pacientes epilépticos, aproximadamente un tercio no responde adecuadamente a un tratamiento farmacológico correcto.
Los pacientes con epilepsia resistente a fármacos sufren un mayor riesgo de daño cerebral, accidentes, muerte prematura y de exclusión sociolaboral que los pacientes con epilepsia controlada. Esta situación es particularmente grave en pacientes pediátricos. Por otra parte, más del 75% del gasto sanitario generado por la epilepsia se concentra en este grupo de pacientes.
En España, la prevalencia a lo largo de la vida de la epilepsia es de 14,87 casos por 1.000 personas mayores de 18 años. Por lo tanto, actualmente hay alrededor de 400.000 personas con epilepsia en España, y cerca del 30% son resistentes a los fármacos.
Un buen número de pacientes con epilepsia resistente a fármacos puede beneficiarse de un tratamiento neuroquirúrgico. La cirugía de la epilepsia no es en absoluto un tratamiento del último recurso para estos pacientes. De hecho, dada la evidencia acumulada y sus resultados favorables, la neurocirugía es el tratamiento de elección en determinados casos de epilepsia.
La cirugía de la epilepsia ofrece también una oportunidad única para estudio de muestras de cerebro epiléptico humano. Es esta oportunidad única una de las motivaciones fundamentales de la presente tesis doctoral. La elevada prevalencia de la enfermedad y la persistencia de crisis en una proporción notable de pacientes hace que la investigación en este campo sea especialmente necesaria.
La etiología exacta de la epilepsia no se conoce con exactitud. No obstante, cualquier lesión cerebral dependiendo de su gravedad tiene el potencial de inducir crisis que pueden convertirse más adelante en epilepsia. El progreso hacia tratamientos más eficaces de la epilepsia requiere conocer mejor los mecanismos subyacentes a la aparición de crisis epilépticas y al daño cerebral causado por las mismas.
Los modelos animales han sido básicos en la comprensión de la fisiopatología de la epilepsia y en los estudios preclínicos para desarrollo de nuevos fármacos. A pesar de su indiscutible utilidad, estos modelos presentan limitaciones, tanto por el predominio de experimentos con epilepsia aguda o por las diferencias metabólicas entre especies. Por ello sus hallazgos deberían ser corroborados por estudios en especímenes humanos. La cirugía de la epilepsia facilita el acceso a esta inestimable fuente de información mediante un acto terapéutico de eficacia y seguridad demostradas.
Hay pruebas sólidas que vinculan la neuroinflamación mediada por eicosanoides y el estrés oxidativo a la iniciación y progresión de la epilepsia en modelos experimentales.
Los eicosanoides (metabolitos del ácido araquidónico) son moléculas de señalización muy potentes, implicadas en una gran variedad de mecanismos fisiológicos y patológicos. Las crisis activan fosfolipasa A2 citosólica (PLA2), liberando el ácido araquidónico (AA) de los fosfolípidos de membrana. El AA es transformado en prostanoides (eicosanoides de la familia de las prostaglandinas (PG)) por el enzima ciclooxigenasa (COX). La isoenzima inducible de COX (COX-2) ve aumentada su transcripción en ante varios estímulos proinflamatorios o sustancias exógenas como el ácido kaínico (KA) o el pentilenotetrazol (PTZ), que inducen crisis en animales de laboratorio. El aumento de eicosanoides cerebrales en relación con las crisis epilépticas también se ha verificado en humanos.
La PGE2 es la prostaglandina principal en los modelos de inflamación aguda y crónica, tanto central como periférica. La PGI2 es la prostaglandina principal formada en los vasos sanguíneos cerebrales, y es un potente vasodilatador. El TXA2 es uno de los vasoconstrictores más potentes que se conocen, y se libera durante la agregación plaquetaria. Existen evidencias de que TXA2 también está implicado en procesos autoinmunes e inflamatorios cerebrales en humanos.
Así pues, el TXA2 induce vasoconstricción y la agregación plaquetaria, que pueden causar lesión neuronal isquémica y astrogliosis reactiva, mientras que prostaciclina I2 (PGI2) produce efectos opuestos en el lecho vascular y las plaquetas. Por tanto, el efecto final (vasodilatación o vasoconstricción, agregación plaquetaria o no) se basa menos en los niveles absolutos de dichos eicosanoides que en la relación entre ambos, es decir, la proporción de TXA2/PGI2.
La vía lipoxigenasa convierte el AA a leucotrienos (LT) por la activación de la enzima 5-lipoxigenasa (5-LOX), dando lugar a la biosíntesis de LTA4, LTB4, y de cisteinil-leucotrienos (LTC4 a LTF4). El LTB4 es un potente quimiotáctico, mientras que LTC4 y LTD4 aumentan la permeabilidad vascular, contribuyendo a la inflamación, en especial a nivel respiratorio.
Otra consecuencia importante de la activación COX-2 es la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) con efectos potencialmente dañinos sobre los lípidos, las proteínas y el ADN, lo que significa un aumento del estrés oxidativo del tejido cerebral. Las especies reactivas de oxígeno se generan en este caso en el nivel del endoperóxido, durante la síntesis de los metabolitos de la COX.
El estrés oxidativo se define como el desequilibrio que surge en un sistema biológico cuando la actividad oxidante vinculada a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) excede la capacidad antioxidante endógena. Se considera que las ROS y las especies reactivas de nitrógeno (RNS) juegan un papel importante en diversas enfermedades del sistema nervioso, como el traumatismo craneoencefálico, enfermedad cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y ataxia de Friedreich.
El estrés oxidativo puede llegar a desencadenar crisis epilépticas. A su vez, una intensa actividad convulsiva, como la producida en modelos animales, puede llevar a efectos citotóxicos mediados por el estrés oxidativo.
De ahí nuestro interés en verificar el estado oxidativo en el cerebro epiléptico humano, analizando sus marcadores. Un mediador central del estrés oxidativo es el anión superóxido celular (O2-), que influye tanto en procesos fisiológicos como patológicos.
La principal fuente fisiológica de O2- es la mitocondria, sede de la fosforilación oxidativa. Los mecanismos citotóxicos por los cuales ROS inducen daño neuronal son tanto el ataque oxidativo directo sobre biomoléculas (proteínas, lípidos, ácidos nucleicos) como la iniciación o propagación de la reacción en cadena de radicales libres, que, en última instancia, conduce al daño macromolecular.
La oxidación del ADN y la peroxidación lipídica son especialmente relevantes en la relación entre epilepsia y lesión neural en los humanos. Se ha establecido que ROS dañan el ADN por un mecanismo de oxidación, produciendo 8-oxo-7,8-dihydro-2´-desoxiguanosina (8-oxo-DG), considerado como uno de los biomarcadores más importantes de estrés oxidativo celular generalizado.
La lesión oxidativa por peroxidación lipídica de las neuronas es muy relevante debido su alto contenido en ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), muy susceptibles a la peroxidación lipídica. La oxidación de los PUFAs altera la estructura de la membrana y su permeabilidad, pudiendo ocasionar neurodegeneración en ultima instancia.
Además, la oxidación de los PUFAs de 20 átomos de carbono, como el ácido araquidónico, provoca una marcada alteración en el equilibrio eicosanoides (eicos=20). Como ya se ha mencionado, las principales consecuencias del desequilibrio eicosanoides en el cerebro están relacionadas con la microcirculación cerebral y con la neuroinflamación.
2 Hipótesis I. En el neocórtex de los seres humanos con epilepsia establecida se producen fenómenos neuroinflamación mediados por eicosanoides.
II. En el neocórtex de los seres humanos con epilepsia establecida se genera un estado de estrés oxidativo.
III. La intensidad de ambas alteraciones es proporcional a la gravedad de la epilepsia del paciente.
IV. La neuroinflamación y el estrés oxidativo en el neocórtex de pacientes epilépticos son equivalentes a los descubiertos en los modelos experimentales de epilepsia.
V. Los modelos experimentales de epilepsia, pese a sus características (duración limitada, metabolismo no humano) son válidos, y proporcionan una información relevante sobre la neuroinflamación y el estrés oxidativo en neocórtex humano expuesto de manera crónica a crisis epilépticas.
3 Objetivos Aunque existen pruebas experimentales muy sólidas de la presencia de neuroinflamación y de estrés oxidativo cerebral en modelos experimentales de epilepsia, estos hallazgos no se han verificado de manera tan inequívoca en el cerebro epiléptico humano.
El propósito principal del presente estudio es determinar y comparar la presencia de neuroinflamación y estrés oxidativo en el neocórtex de humanos con y sin epilepsia, para confirmar ambos fenómenos en la fisiopatología de la epilepsia humana y sugerir así nuevas estrategias terapéuticas: i. Neuroinflamación, a través de la determinación de niveles cerebrales de eicosanoides, incluyendo prostanoides (TXA2, la PGE2 y la PGI2) y leucotrienos (LTB4 y LTC4).
ii. Estrés oxidativo, cuantificando sus marcadores principales: especies reactivas de oxígeno (O2-), actividad de enzimas antioxidantes (SOD, catalasa, GPx, GR) y marcadores de daño a biomoléculas (peroxidación de lípidos, oxidación de proteínas y oxidación de ácidos nucleicos).
iii. Identificar una posible correlación entre la intensidad de la alteración de los parámetros citados y la gravedad de la epilepsia del paciente.
iv. Comparar los hallazgos en muestras de neocórtex humano epiléptico con los obtenidos por los modelos experimentales de epilepsia, para contribuir a su validación mutua, y a la investigación traslacional en epilepsia.
4 Métodos 4.1 Muestras de neocórtex humano Los especímenes quirúrgicos se obtendrán de veinte (n = 20) pacientes con epilepsia resistente a fármacos, operados consecutivamente por el mismo cirujano en el Hospital Clínic de Barcelona. La selección de los pacientes candidatos a cirugía de la epilepsia, así como la determinación de la zona epileptógena a extirpar, se establecerá según los resultados del protocolo de evaluación multidisciplinaria de la Unidad de Epilepsia del Hospital Clínic de la Universitat de Barcelona. Se registrarán los parámetros más relevantes de la epilepsia de cada paciente, en especial la frecuencia media de las crisis antes de la cirugía.
El procedimiento neuroquirúrgico consistirá en la extirpación microquirúrgica de la zona epileptógena con el objetivo de controlar las crisis epilépticas. Con el fin de mantener una uniformidad entre las muestras, todas ellas procederán de tejido neocortical. De esta porción principal, apartaremos una muestra neocortical de aproximadamente 1 cm3, que se congelará en el quirófano inmediatamente por inmersión en nitrógeno líquido, y quedará almacenada a −80º C en el laboratorio. El Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Clínic de Barcelona ha autorizado este estudio.
Los especímenes de control, muestras de corteza cerebral humana no epiléptica (n = 11), serán proporcionadas por el Banco de Tejidos Neurológicos del Instituto de Neuropatología del Hospital Universitario de Bellvitge. Dichas muestras procederán de donantes cuya causa de fallecimiento no podrá estar relacionada con enfermedades o lesiones cerebrales.
4.2 Determinación de niveles de eicosanoides y de marcadores de estrés oxidativo • Ensayo eicosanoides: Enzimoinmunoensayo • Anión superóxido (O2-): Técnica de bioluminiscencia por reacción con Tyrode y lucigenina.
• Superóxido dismutasa (SOD): Método espectrofotométrico de auto-oxidación de la quecitina por O2-.
• Catalasa: Método espectrofotométrico. Reacción catalasa-metanol con supresión del H2O2 de la muestra.
• Glutatión peroxidasa (GPX): Método espectrofotométrico. Reducción de hidroperóxido de tert-butilo y oxidación de la NADPH.
• Glutatión Reductasa (GR): Método espectrofotométrico. Oxidación de NAPDH.
• Peroxidación lipídica: Método espectrofotométrico. Sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) con el malondialdehído (MDA).
• Determinación de proteínas: Método espectrofotométrico de determinación de fenoles provenientes de la tirosina de folín-Ciocalteu.
• Oxidación de ADN: Determinación de 8-oxo-dG mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
5 Resultados 10.5.1 Niveles de eicosanoides en el neocórtex de pacientes con epilepsia Los tres metabolitos de la vía COX (PGE2, TXA2 y PGI2) mostraron un notable aumento en las muestras de pacientes con epilepsia.
La relación TXA2/PGI2 es un marcador de neuroinflamación más representativo que los valores absolutos en sí mismos. En el neocórtex epiléptico, los niveles del TXA2 fueron 2 veces superiores a los niveles de la PGI2.
En la vía de la LOX, los resultados obtenidos para el LTB4 y el LTC4 fueron indetectables con nuestro enfoque metodológico.
El análisis de correlación entre los niveles de los eicosanoides y la frecuencia de CF en cada paciente detectó una correlación positiva para TXA2 y PGI2.
5.2 Marcadores de estrés oxidativo en el neocórtex de pacientes con epilepsia Detectamos un incremento muy importante en los niveles de O2- en el neocórtex de pacientes epilépticos, del 337% en los pacientes epilépticos en relación con el grupo control.
La actividad de la enzima SOD no mostró diferencias significativas entre el control y el grupo de pacientes epilépticos.
La actividad de la catalasa presentó un incremento del 95% en relación con el grupo de control.
La actividad de la enzima GPx en el neocórtex epiléptico fue el 30% menor que en los controles.
Los niveles de TBARS, indicadores de peroxidación lipídica, no mostraron diferencias significativas.
Con respecto al daño crónico al ADN inducido por las ROS, la 8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) presentó un aumento del 284% en relación con el grupo control.
6 Discusión Los resultados obtenidos de la corteza epiléptica humana han sido contrastados con los obtenidos a partir de animales de laboratorio, en los cuales las crisis suelen ser provocadas con KA, PTZ o pilocarpina. Estos agentes pueden inducir crisis límbicas progresivos en las ratas, que se asemejan a la epilepsia humana del lóbulo temporal, el tipo más común de epilepsia humana adulta. Todos los pacientes en el presente estudio, excepto uno, padecían de epilepsia del lóbulo temporal. Los hallazgos en nuestros pacientes coinciden en gran medida con los resultados en modelos experimentales Nuestros resultados muestran un aumento significativo en los metabolitos de ácido araquidónico de la vía de la COX, PGE2, TXA2 y de PGI2 en las muestras neocorticales de pacientes epilépticos, en comparación con los resultados obtenidos en las muestras de sujetos no epilépticos del grupo control. El aumento observado de eicosanoides en pacientes epilépticos está de acuerdo con los datos que implican la liberación y transformación de ácido araquidónico durante las crisis.
Nuestro hallazgo de una correlación positiva entre la frecuencia de crisis focales para un paciente dado y el aumento de los niveles de dos eicosanoides (TXA2 Y PGI2) indica un carácter acumulativo o progresivo de la neuroinflamación con las crisis, especialmente de los mecanismos microvasculares.
No evidenciamos activación de la vía lipoxigenasa (LTB4 Y LTC4). Este resultado está de acuerdo con los obtenidos por otros autores en modelos de inducción de crisis con KA y PTZ. La ausencia de leucotrienos en el neocórtex de nuestros pacientes evidencia que la vía principal en fenómenos inflamatorios en el cerebro humano es la de COX.
Las convulsiones inducidas por KA en modelos animales aumentan los niveles de PGE2 en hipocampo y corteza cerebral. Hay pruebas experimentales de que PGE2, una de las principales prostaglandinas sintetizadas en el cerebro de los mamíferos, facilita las convulsiones y la muerte neuronal. Inhibidores de la COX-2 como el Celecoxib, o el Rofecoxib, disminuyen los niveles de PGE2 y limitan la muerte neuronal causada por las crisis, la activación microglial, la neurogénesis y la astrogliosis reactiva en el hipocampo y neuronas corticales.
El anión del superóxido (O2-) demostró un aumento altamente significativo en el neocórtex de los pacientes con epilepsia. La importancia de este radical libre en la inducción de crisis se sustenta en los resultados obtenidos con animales transgénicos. Los ratones transgénicos que sobreexpresan el SOD mitocondrial (SOD2) son resistentes daño neuronal oxidativo inducido por las crisis, mientras que los ratones con deficiencia parcial de SOD2 (Sod2±) sufren una la exacerbación de la susceptibilidad a las crisis. Estos estudios sugieren que O2− puede desempeñar un papel muy importante en el daño cerebral inducido por crisis.
No hemos encontraron diferencias significativas en la actividad de la SOD. Los estudios experimentales sobre SOD y epilepsia también obtienen resultados aparentemente contradictorios. Este hallazgo negativo se podría explicar por el aumento simultáneo de la expresión y de la degradación SOD causada por el estrés oxidativo. Por ejemplo, por la capacidad de H2O2 de inactivar SOD.
La catalasa es capaz de eliminar grandes cantidades de H2O2 muy rápidamente, aunque sus niveles son comparativamente más bajos en el tejido cerebral que en otros órganos. Hemos encontrado un aumento significativo de la catalasa se encontró en el neocórtex de los pacientes epilépticos, coincidiendo con los resultados obtenidos en animales de laboratorio. El aumento notable en actividad de la catalasa se interpreta como respuesta antioxidante enzimática al aumento de la producción de ROS.
GPX es muy eficiente en la destrucción de pequeñas cantidades de H2O2. Los resultados en pacientes con epilepsia muestran una disminución significativa en los niveles de GPX, que podría ser el resultado del aumento de su inactivación. Los resultados en animales de laboratorio para GPX presentan resultados contradictorios. Nuestros hallazgos con respecto al sistema GPX-GR parecen indicar que este sistema desempeña un papel menor como scavenger de radicales libres en la corteza epiléptica humana, pero suficiente para los mantener el glutatión en su estado reducido (GSH).
En cuanto a la peroxidación lipídica, hemos encontrado diferencias entre los niveles de TBARS en muestras y controles epilépticos. En los modelos de KA y pilocarpina, se produce un aumento transitorio de TBARS, que se normaliza en unas 12 horas. Esta “normalización” puede sugerir hipometabolismo, pérdida neuronal y/o mecanismos compensatorios que pueden estar modulando activamente las enzimas relacionadas con el catabolismo de ROS.
En cuanto a la oxidación del ADN, encontramos un aumento muy significativo en los niveles de 8-oxo-DG en los pacientes con epilepsia en comparación con los controles. Se han observado resultados paralelos en los modelos agudos y crónicos de epilepsia, y afecta especialmente al ADN mitocondrial. Si las crisis son continuadas, la capacidad de reparación del ADN (vía BER) puede quedar desbordada y producirse daños permanentes en el ADN, envejecimiento celular y apoptosis.
En resumen, los hallazgos presentados coinciden con los de los modelos experimentales. Puede afirmarse que el estrés oxidativo es un fenómeno clave también en la epilepsia humana. El aumento en la catalasa y la disminución en GPX, junto con los niveles estables de GR, sugieren que la catalasa sea el antioxidante enzimático principal en la corteza epiléptica humana. El aumento sustancial de los niveles de O2- y 8-oxo-DG en pacientes epilépticos, dan soporte a la conexión entre las crisis crónicas y el daño neural mediado por ROS. La modulación del equilibrio oxidativo podría tener potencial terapéutico en epilepsia.
7 Conclusiones 7.1. El marcado incremento de los niveles de prostaglandinas y tromboxano en pacientes tratados mediante cirugía confirma la presencia de neuroinflamación mediada por eicosanoides en el cerebro de pacientes con epilepsia.
7.2. El aumento de los marcadores de estrés oxidativo a nivel cerebral, junto con el aumento de la peroxidación lipídica y la oxidación del ADN, corroboran un estado de estrés oxidativo sostenido en la epilepsia humana.
7.3. La relación entre la frecuencia de crisis epilépticas focales de los pacientes y sus niveles neocorticales de Tromboxano A2 y de Prostacilclina, indica cierto grado de proporcionalidad entre la gravedad de la epilepsia y el daño neural asociado.
7.4 .La coincidencia de los hallazgos en el cerebro humano con epilepsia establecida valida los resultados obtenidos en los modelos experimentales, pese a sus disparidades metodológicas.
7.5. La inhibición selectiva de la síntesis o de los receptores de prostanoides, y los tratamientos dirigidos a restablecer el equilibrio oxidativo cerebral podrían ser nuevas líneas de investigación terapéutica en la epilepsia.
En la actualidad, la gran mayoría de los llamados “fármacos antiepilépticos” tiene como diana terapéutica el control de la hiperexcitabilidad e hipersincronía neuronal mediante la modulación de los canales iónicos y de la neurotransmisión. Por lo tanto, su acción principal es en realidad “anticonvulsivante”. Esta estrategia, aunque realmente efectiva en el control de las crisis, no aborda el problema de la instauración y progresión de los cambios patológicos que constituyen el sustrato de la epilepsia.
Si el daño neural causado por las crisis está vinculado al estrés oxidativo y a la neuroinflamación, cabe suponer que tratamientos dirigidos a modular estos fenómenos podrían no sólo limitar el daño causado por las crisis, sino que, aplicados en fases iniciales, tendrían el potencial de modificar la consolidación o la progresión de la enfermedad epiléptica.
