Resumen de Relació de la paraoxonasa pon1 amb l'estrès oxidatiu en l'afectació microvascular en la retinopatia diabètica
JUSTIFICACIÓ I NECESSITATS DE LA INVESTIGACIÓ: La diabetis va en augment: la prevalença de la malaltia, que ha deixat d'afectar predominantment als països rics, està augmentant de manera progressiva a tot arreu, sobretot en els països d'ingressos mitjans.
Malauradament, en molts llocs la manca de polítiques i eficaços per a la creació d'ambients conduents a maneres de vida sans i la manca d'accés a una bona assistència sanitària es tradueixen en una falta d'atenció a la prevenció i al tractament de la diabetis, sobretot en el cas de persones d'escassos recursos.
Quan la diabetis no està atesa, les conseqüències per a la salut i el benestar són greus.
La diabetis i les seves complicacions tenen, a més, efectes econòmics nefastos per a les persones i les seves famílies, així com per a les economies nacionals. Les persones amb diabetis que depenen de la insulina per sobreviure paguen amb la vida quan no tenen accés a ella a un cost assequible.
A fi de fer front a aquest problema de salut en ascens, a principis del present segle els líders mundials es van comprometre a alleujar la càrrega de diabetis i les seves complicacions, una de les quatre malalties no transmissibles (ENT) d'importància prioritària.
Els pacients que desenvolupen retinopatia diabètica inicien la patologia amb canvis mínims en la retina que a poc a poc es van agreujant i tornant-se irreversibles amb un procés principal com a causant: l’estrès oxidatiu.
Les lipoproteïnes de baixa densitat (LDL) oxidades han demostrat ser citotòxiques per a les cèl·lules endotelials dels capil·lars de la retina i els perícits, també presents en la membrana basal, ja que estan implicades en el mecanisme un mecanisme que contribueix al desenvolupament de la retinopatia diabètica. El reconeixement de la implicació directa de les LDL oxidades en el dany directe a nivell vascular desperta un gran interès alhora de poder aconseguir mecanismes que impedeixen aquesta oxidació. Un d’aquests mecanismes de prevenció recau en les lipoproteïnes d’alta densitat, que sembla disminuir l’acumulació de peròxids de lípids de lipoproteïnes de baixa densitat gràcies a un mecanisme, en part, enzimàtic: l’enzim associat a les lipoproteïnes d'alta densitat és la PON1. La hipòtesi central plantejada és que els enzims paraoxonasa PON1 i PON3 juguen un paper molt important en la regulació de l’estrès oxidatiu i la resposta inflamatòria mediada per molècules d'adhesió de cèl·lules endotelials CCL-2, i pot ser un punt determinant per a desencadenar l’afectació microvascular retiniana que marcarà la progressió de la retinopatia diabètica. A partir d’aquí volíem estudiar, a part de la presencia en humor vitri de PON1 i PON3, si existia alguna relació entre aquests i el grau d’afectació vascular retiniana.
Fins a dia d'avui s'ha observat que l’activitat PON1 està disminuïda en diabètics, associa un augment de la peroxidació de lípids que contribueix a ser un factor determinant per a la predisposició de les complicacions de la diabetis mellitus (DM).
METODOLOGIA EMPRADA: Estudi tipus sèrie clínica amb recollida de les dades necessàries per l’estudi de tipus prospectiu.
63 ulls de 63 pacients derivats a l ’Hospital Universitari Sant Joan de Reus per a ser intervinguts per retinopatia diabètica, per edema macular diabètic traccional en les seves diferents formes, edema macular diabètic crònic, o bé per presentar forat macular o membrana epiretiniana idiopàtica.
Subjectes d'estudi: en total es recolliran mostres en 63 ull de 63 malalts: 1. Malalts diabètics, en total varen ser 32 malalts: a) Edema macular diabètic de tipus traccional (bé per tracció vitri-retina o membrana epiretiniana) b) Edema macular diabètic crònic que no respon als tractaments amb intravitries de anti-VEGF o corticoides, c) Malalts amb retinopatia diabètica proliferativa quirúrgica 2. Grup control, per determinar els valors de paraoxonasa PON1 a nivell de vitri o membranes retinianes en aquells malalts sense diabetis mellitus, estarà format per 30 malalts que requereixin vitrectomia per presentar: forat macular o membrana epiretiniana idiopàtica. En total van ser 31 ulls de 31 malalts.
Selecció de malalts:per entrar en l’estudi es va fer de manera aleatòria a partir dels malalts derivats per realitzar vitrectomia per presentar qualsevol de les patologies indicades en el present estudi, com malalts del grup d’estudi o malalts del grup control.
Potència d'estudi:basant-se en un possible error en la determinació dels nivells de PON1 i PON3 a nivell intraocular, i per obtenir un nivell de significació alfa de 0,05 i una potencia beta de un 95%, es necessiten 50 malalts en el grup estudiat.
Variables Determinació de les següents variables: 1. Dades demogràfiques dels malalts: sexe, edat, raça 2. Dades pròpies de la diabetis mellitus (DM): Edat de diagnòstic, temps de duració de la DM, tipus de tractament de la DM (dieta, antidiabètics orals, insulina), presencia de hipertensió arterial (HTA).
3. Dades analítiques generals: HbA1c (valor normal < 7%), perfil lipídic (valorar dislipèmia), proteïna C reactiva 4. Dades analítiques especials: Determinació en sèrum/plasma: a) activitat paraoxonasa en sèrum (U/L) b) activitat lactonasa en sèrum (U/L) c) concentració de PON 1 i 3 en sèrum (mg/L) d) concentració de PON 1 i 3 en humor vitri i les seves activitats específiques (mg/dl) e) Immunohistoquímica en les membranes retinianes i en el vitri: concentració de paraoxonasa PON1, concentració de 4-hidroxi-nonenal.
Recollida i anàlisi de dades En els malalts quirúrgics de retinopatia diabètica bé per retinopatia diabètica proliferativa amb tracció vitri-retina, o bé per presencia de edema macular diabètic de tipus traccional, es va practicar vitrectomia pars plana de 25 g o 20 g, amb recollida del vitri sota aire que va ser enviat a anatomia patològica en primer terme, igualment la membrana retiniana en el seu cas va ser impregnada amb eosina primer i derivada a anatomia patològica.
En els dos casos (vitri o membrana, en anatomia patològica seran la primera (vitri) sotmesa a centrifugat i el dipòsit enviat a laboratori, en cas de la membrana serà observada sota microscòpia òptica i després inclosa en bloc de parafina i tallada amb micròtom.
Des de anatomia patològica els dos tipus de mostres varen ser enviats al laboratori de investigació on han estat sotmesos a inmunohistoquímica per determinar les diferents dades analítiques especials abans esmentades.
Paral·lelament en el preoperatori a més de l’analítica habitual s’extrauran les mostres suficients per determinar en sèrum / plasma les dades analítiques especials abans esmentades.
Anàlisis estadístic Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar amb el programa estadístic SPSS 21.0. El grau de significació mínima es va establir a P ≤0.05 a cada test.
Es van utilitzar mètodes estàndard (Kolmogorov-Smirnov i Shapiro-Wilks) per comprovar si les variables seguien una distribució normal.
Es varen fer determinacions de les freqüències i estudi descriptiu dels malalts inclosos en la mostra, tan del grup d’estudi com del grup control, respecte a les variables demogràfiques, variables pròpies de la diabetis mellitus, dels diferents tipus de retinopatia que presenten, i de les dades obtingudes en els anàlisis dels paràmetres estudiats (entre ells està la determinació de la PON1 i PON3) Les diferències entre dos grups es van analitzar amb el test t-Student (paramètric) o amb el test U-Mann-Whitney (no paramètric). Les diferències entre múltiples grups es van analitzar amb l’ANOVA.
Per l’estudi de les variables qualitatives com les derivades de la pròpia diabetis mellitus o la presencia de retinopatia diabètica l’estudi univariant es farà amb l’aplicació de l’estadígraf Chi quadrat. Per avaluar el grau d’associació entre dues variables es van utilitzar els coeficients de correlació de Pearson (paramètric) i Spearman (no paramètric) o el test de Kruskall Wallis (categòric).
CONCLUSIONS: 1. El nostre projecte va mostrar una disminució de PON1 i PON3 a nivell de sèrum/plasma al comparar ulls diabètics i no diabètics, amb significació estadística, que suggereixen que davant un increment de l'estrès oxidatiu en diabètics existeix un augment de producció d'aquests enzims per poder fer front a l'alteració metabòlica. Tanmateix els valors de la mitja al comparar el subgrup de ulls de pacients amb retinopatia diabètica amb els ulls de pacients diabètics i ulls de pacients no diabètics, també mostra un augment d'aquest valor.
2. En els casos de ulls amb hemovitri vam trobar disminució de la mitja de PON1 en vitri, i PON3 augmentada, respecte als valors generals de la mostra. Tenint en compte que tots els casos de hemovitri del estudi eren diabètics podem deduir que PON 1 i PON 3 no actuarien de la mateixa manera.
3. Es va observar una disminució de producció de PON1 i PON3 en humor vitri entre els ulls dels pacients diabètics, comparant-los amb els no diabètics, amb significació estadística. Podem afirmar la manca de presència enzimàtica en el humor vitri d'aquests pacients.
4. Es va observar una disminució de producció de PON1 i PON3 en humor vitri, amb significació estadística, al comparar els ulls de pacients diabètics sense edema macular, respecte als que tenen edema macular, valor aquest últim superior als ulls de pacients no diabètics. Podem afirmar que hi ha una clara relació entre els valors de PON1 i PON3 i la presència de edema macular diabètic 5. La ratio de PON 1 i PON3 en vitri/sèrum esta augmentada en els ulls de pacients diabètics amb edema macular, en relació amb els ulls de pacients diabètics sense edema macular per tant podem suposar que la presència d’edema macular indueix un augment de PON1 i PON3 intravitri per una producció interna a nivell ocular.
6. Es va demostrar una correlació positiva amb significació estadística entre els graus d'activitat paraoxonasa i lactonasa en humor vitri i el valor de HbA1c dels ulls diabètics. Creiem que es una troballa important tenint en compte que l'HbA1c és un dels marcadors de l'estat diabètic del malalt a mig/llarg termini, es va visualitzar clarament seguint les línies de tendència de les gràfiques de correlació.
7. Respecte a les membranes epiretinianes analitzades es va observar la presència de PON 1 tant en els malalts amb MER idiopàtica i en els malalts amb MER secundària a DM, però només en aquests últims vam detectar la presència de 4-hidroxi-2-nonenal, el que suggereix que hi ha activitat de estrès oxidatiu en els malats amb MER secundària a diabetis.
