Determinació cromatogràfica de melamina en mostres alimentàries i fisiològiques
- Autores: Beatriz Beltrán Martinavarro
- Directores de la Tesis: Josep-Salvador Esteve i Romero (dir. tes.), Juan Peris Vicente (codir. tes.), Samuel Carda-Broch (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Jaume I ( España ) en 2013
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jóse Vicente Gimeno Adelantado (presid.), José Manuel Estela Ripoll (secret.), Maria Jose Ruiz Angel (voc.)
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
Introducció La melamina és un compost orgànic ampliament utilitzat en la industria. A causa de l'elevat contingut en nitrogen, ha sigut utilitzada fraudulentament per a adulterar aliments i pinsos, ja que produeix un fals increment del contingut proteic. Els mètodes utilitzats normalment per a l'anàlisi de proteïnes no permeten distingir entre el nitrogen provinent de proteïnes i el nitrogen provinent d'altres fonts. Aquest fet fa que s'obtinguen mesuraments erronis d¿alt contingut proteic en productes que contenen nitrogen de fonts no proteiques, i constitueix un incentiu econòmic per a la seua incorporació il·legal.
Objectius L' objectiu principal de la investigació ha estat el desenvolupament de nous mètodes d¿anàlisi per a la identificació i quantificació de la melamina d'una manera fidedigna i per sota dels límits legals, en diferents matrius (llet, suplements dietètics, aigua, orina, plasma i renyó de porc) mitjançant l¿MLC.
La finalitat ha sigut el disseny de mètodes senzills, ràpids i relativament econòmics per a detectar l¿incompliment de la normativa internacional, en les àrees tant de qualitat com de seguretat alimentaria, així com per a avaluar el risc per als humans derivat de la melamina.
Un altre dels objectius ha sigut la validació dels mètodes desenvolupats.
Metodología Tres dècades després del seu inici en 1980, i amb els fonaments ben establits, la cromatografia líquida micel·lar (MLC) es confirma com una alternativa vàlida front a la cromatografia líquida en fase inversa clàssica (RP-HPLC). Les fases mòbils que fa servir, amb una concentració de tensioactiu per damunt de la concentració micel·lar crítica (CMC), possibiliten la implementació de noves formes d¿interaccions (hidrofòbiques, electrostàtiques i estèriques) dins de la columna. La fase estacionària es modifica amb una quantitat aproximadament constant de monòmers de tensioactiu, mentre que un augment en la concentració d'aquest dóna lloc a un increment de les micel·les en la dissolució. La varietat d¿interaccions que es produeixen dins dels tres ambients implicats, micel·les, fase hidroorgànica i fase estacionària, singularitzen aquesta tècnica, i la doten d¿una gran versatilitat. Aquest fet, juntament amb la baixa toxicitat de les fases mòbils, amb un 90 % d¿aigua o més, i el relatiu baix cost econòmic de desenvolupament, ha donat lloc a un augment en el nombre d¿aplicacions analítiques. L'addició d¿un modificador orgànic augmenta la força eluent i les eficàcies. L'estratègia d'optimització interpretativa ha demostrat ser una eina molt eficaç en la recerca de les condicions òptimes que cal aplicar en un mètode nou. Basada en l'aplicació d'algoritmes capaços d'nferir el comportament en el sistema cromatogràfic en variar el valor dels factors experimentals, disminueix el nombre d'assajos necessaris per a obtenir bones resolucions, i minimitza d¿aquesta manera els recursos implicats en l'obtenció de resultats satisfactoris.
Conclusions Desenvolupament d'un mètode analític per a quantificar melamina en llet mitjançant Cromatografia Líquida Micel·lar i validació d'acord amb el Reglament de la Comissió Europea 2002/654/EC Es va desenvolupar un procediment cromatogràfic, que fa ús d'una columna C18, una fase mòbil de dodecilsulfat sòdic (0,05 M)-propanol (7,5 %), tamponada a pH 3, i detecció a 210 nm, per a la detecció i quantificació de melamina en mostres de llet, tant líquides com en pols. En aquest treball, les mostres van ser diluïdes amb una solució d'SDS i injectades directament. No va ser necessària cap extracció prèvia per a precipitar les proteïnes de la matriu, ja que aquestes són solubilitzades per les micel·les. L'analit va eluir en 9,3 min sense solapar-se amb la banda de les proteïnes o altres compostos endògens de la matriu. La resolució de l'analit es va aconseguir mitjançant l¿aplicació d'un mètode quimiomètric, en què en una primera etapa es modelitza la retenció a partir dels paràmetres cromatogràfics obtinguts en tan sols cinc fases mòbils. La descripció de la forma dels pics cromatogràfics es va realitzar amb un model gaussià modificat. La validació es va dur a terme seguint les directrius del Reglament de la Comissió Europea (Decisió 2002/657/CE). Els principals paràmetres estadístics estudiats van ser: linealitat (0,02-100 ppm; r2=0,999), límit de decisió (CC¿), capacitat de detecció (CCß), límit de detecció (50 ppb), precisió intradia i interdia (RSD < 7,6 % i < 9,7 %, respectivament) i robustesa (RSD < 7,4 % per al temps de retenció i < 5,0 % per a l¿àrea). La sensibilitat va ser adequada per a detectar la melamina per sota dels límits establits internacionalment (1 ppm per a llet en pols i 0,15 ppm per a llet líquida). Finalment, les recuperacions per a les diferents mostres de llet van estar compreses dins del interval 85-109 % .
Ús de fases mòbils micelars per a la determinació cromatogràfica de melamina en suplements dietètics.
En aquest treball es desenvolupa un procediment cromatogràfic líquid que fa servir una fase mòbil de dodecilsulfat sòdic (SDS) tamponat a pH 3, una columna C18 i detecció UV per a la determinació de melamina en suplements dietètics. Les mostres van ser reconstituïdes amb una solució d'SDS i directament injectades, cosa que evitava qualsevol mena de procediment d¿extracció. La melamina va eluir en menys de 10 minuts sense interferències amb els altres compostos de la matriu. La composició de la fase mòbil òptima es va obtenir aplicant una estratègia d'optimització interpretativa que considera el factor de retenció, l'eficàcia i la forma dels pics cromatogràfics. El mètode va ser validat d¿acord amb els requisits del Reglament de la Comissió Europea (Decisió 2002/657/CE). Es van considerar els següents paràmetres: linealitat (0,02¿100 µg mL-1; r2 = 0,9996), precisió intradia i interdia (< 12,4 %), exactitud (90,0¿101,3 %), i robustesa (menys del 9,8 % i 5,1 %, per al temps de retenció i pic de l¿àrea, respectivament). Els límits de detecció i quantificació van ser 90 i 200 ng mL-1, respectivament. Les recuperacions per a diferents mostres addicionades van estar compreses dins del rang 85,8¿114,3 %. Els resultats indiquen que la metodologia proposada és pot utilitzar en l¿anàlisi rutinària de control de qualitat en fórmules, tant infantils com per a adults, de suplements dietètics. El límit de detecció va ser inferior al límit establit internacionalment (2 ppm). Aquest mètode és respectuós amb el medi ambient atès que únicament fa ús d'un tensioactiu (no inflamable, no tòxic i biodegradable), i a més és relativament econòmic en comparació amb altres mètodes, la qual cosa resulta beneficiosa en moltes ocasions.
Desenvolupament d'una metodologia analítica per a quantificar melamina en aigua apta per al consum i residual mitjançant cromatografia líquida micel·lar A causa de la magnitud de les repercussions en salut pública causades per la contaminació deliberada amb melamina de diversos productes destinats al consum humà i animal, l¿Organització Mundial de la Salut (OMS) i l'Organització de les Nacions Unides per a l'Agricultura i l¿Alimentació (FAO) van fer una sèrie de recomanacions, entre les quals es trobava la necessitat d¿obtenir més dades respecte als nivells de base de melamina tant en l¿aigua residual com en l¿aigua apta per al consum humà (4 de desembre de 2008). Es va desenvolupar un procediment cromatogràfic que fa servir una columna C18, una fase mòbil micel·lar de dodecilsulfat sòdic (0,1M)-propanol (7,5 %), tamponada a pH 3, i detecció a 210 nm, per a la quantificació de melamina tant en aigua residual com de consum. Les mostres van ser filtrades i injectades directament en el sistema cromatogràfic, cosa que evitava llargs procediments d'extracció. La fase mòbil òptima per a l¿assaig es va seleccionar utilitzant un programari que permet l¿observació gràfica dels canvis en els cromatogrames quan l'analista varia progressivament tant la concentració de modificador orgànic com de tensioactiu. Es va aplicar el criteri de màxima resolució, mínim temps d'anàlisi. En les condicions experimentals optimitzades el temps total d'anàlisi va ser de 6,2 min. No es va observar cap interferència dels compostos de la matriu. El mètode va ser validat d'acord amb la guia de l'Oficina d¿Anàlisi dels Medicaments i els Aliments (FDA). Els paràmetres analítics estudiats van ser: linealitat (0,03¿5 ¿g/mL; r2= 0,998), límit de detecció (13 ng/mL), exactitud intradia i interdia (entre 4,1 i 12,2 %), precisió intradia i interdia (per sota de 14,8 %) i robustesa (RSD < 5,1 % temps de retenció i < 9,0 % per a l'àrea). Finalment, el mètode es va aplicar amb èxit a la determinació d'aquest analit en aigua local: residual i de consum, on no es va trobar melamina.
Validació d'un mètode analític per a quantificar melamina en fluids biològics mitjançant cromatografia líquida micel·lar La concentració de melamina mesurada en el plasma i l'orina és útil per a confirmar malalties renals associades amb la ingestió de melamina. Es va optimitzar i validar un mètode simple i sensible per a la determinació de l'analit en fluids biològics, i es va desenvolupar la mateixa metodologia per a les dues matrius, amb el fi de permetre al laboratori clínic l'anàlisi simultània de mostres de plasma i orina. El tractament de la mostra previ a la injecció en el sistema cromatogràfic va consistir únicament en la seua dilució i filtració. La separació analítica es va realitzar en 6,3 min fent servir una columna C18, detecció a 210 nm, i una fase mòbil micel·lar pura de dodecilsulfat sòdic (0.2 M) tamponada a pH 3. L'analit va eluir sense solapar-se amb la banda de les proteïnes o els altres compostos endògens. La composició de la fase mòbil òptima es va determinar estudiant la influència de cada paràmetre cromatogràfic. Es va utilitzar el producte no normalitzat de les fraccions solapades per a optimitzar la resolució. El mètode ací descrit s'ha validat seguint la guia FDA, en termes de precisió intradia i interdia (RSD 0,7-10,2 % i 1,0-9,1 % respectivament), recuperacions, calculades com exactitud (85,7-103,8 % i 94,8-103,6 %, respectivament) i robustesa (RSD < 7,1 %). Els calibratges van ser lineals (r2 > 0,9995 en els dos casos) en l¿interval de concentracions entre 0,25-25 ppm. Els límits de detecció i quantificació van ser 50 ppb i 250 ppb respectivament. Finalment, el mètode proposat es va aplicar a l'anàlisi de mostres reals procedents de voluntaris, i no es va trobar melamina en cap d¿elles. Avui dia el valor de la ingesta diària admesa establit internacionalment és de 0,2 mg/kg de pes corporal. El límit de detecció en el treball que es mostra és de 50 ppb.
Desenvolupament i validació d'un mètode basat en cromatografia líquida micel·lar per a quantificar melamina en renyó de porc La melamina s'ha utilitzat il·legalment per a adulterar pinsos amb la finalitat d'incrementar aparentment el contingut proteic. Açò representa un risc, tant per a la salut dels animals com de la humana, atès que els residus de melamina en els productes d'origen animal poden arribar als humans a través de la cadena alimentària. Es va desenvolupar un mètode senzill i sensible per a la identificació i quantificació rutinària de melamina, mitjançant cromatografia líquida micel·lar, en mostres de renyó de porc. L¿extracció de l'analit, un cop homogeneïtzades les mostres, es va realitzar en metanol amb l'ajuda del bany d'ultrasons. L'analit es va determinar en una columna C18, fent servir una fase mòbil micel·lar de 0,11 M de dodecilsulfat sòdic i 7,5 % de propanol a pH 3. La detecció de l'absorbància va ser a 210 nm. En aquestes condicions, la melamina va eluir en 6,0 min sense interferències amb els compostos endògens. El comportament cromatogràfic de l'analit es va examinar mitjançant un disseny experimental que consistia en cinc fases mòbils (quatre situades en els vèrtexs del rectangle, i la cinquena en el centre, de l'espai bidimensional definit per les concentracions de tensioactiu i modificador). La metodologia va ser validada, utilitzant mostres de renyó no contaminades, d'acord amb els requisits de l'Oficina d'Anàlisi dels Medicaments i els Aliments en termes de: sensibilitat (LOD i LOQ van ser 100 i 300 ppb, respectivament), rang de calibratge (0,3 a 20 ppm), linealitat (r2 > 0,9997), precisió intradia i interdia (< 7,2 % i < 7,6 %, respectivament) i exactitud (91,7-103,6 % i 91-109,3 %, respectivament), i robustesa (< 5,1 %).La alta sensibilitat del mètode indica que fins i tot lleus intoxicacions poden ser detectades. El mètode proposat es va aplicar en l'anàlisi de mostres provinents d'una granja i de un supermercat.
Referències 1. Expert meeting to review toxicological aspects of melamine and cyanuric acid, 1-4 December 2008. Held in collaboration with FAO and supported by Health Canada Ottawa, Canada.
2. Codex Alimentarius Commission 35th Session. Rome, Italy, 2-7 July 2012.
3. J PERIS-VICENTE, S CARDÁ-BROCH, J ESTEVE-ROMERO, M RAMBLA-ALEGRE, D BOSE, B BELTRÁN-MARTINAVARRO, S MARCO-PEIRÓ, A MARTINAVARRO-DOMÍNGUEZ, E OCHOA-ARANDA AND ML CHIN-CHEN, Bioanalysis (2013) 5(4), 481-494.
4. J.R. TORRES LAPASIÓ, MICHROM SOFTWARE, MARCEL-DEKKER, NOVA YORK, EUA, 2000.
