Estudio integral de la interacción planta-patógeno en resistencia inducida

• Autores: Loredana Scalschi
• Directores de la Tesis: Pilar García Agustín (dir. tes.), Begonya Vicedo i Jover (codir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Jaume I ( España ) en 2013
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Fernando Fornes Sebastiá (presid.), Gemma Camañes (secret.), Jaime Cubero (voc.)
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• Resumen

  • Estudio integral de la interacción planta-patógeno en resistencia inducida INTRODUCCIÓN Las plantas ante el ataque de un agente patógeno, activan diferentes procesos que requieren una apropiada señal hormonal. La mayoría de las respuestas frente a patógenos son mediadas por la ruta del ácido salicilico (SA), ácido jasmonico (JA), etileno (ET) y del ácido abscisico (ABA), que pueden actuar de forma sinérgica o antagonista. Estas respuestas pueden reforzarse por la aplicación de compuestos químicos provocando la llamada resistencia inducida, en muchos casos, mediante priming (potencian la respuesta defensiva de la planta sólo en presencia del patógeno). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio usando el ácido hexanoico (Hx) como inductor de resistencia frente a Botrytis cinerea apuntaron a la implicación de la ruta del jasmonico en dicho proceso (Vicedo et al., 2009). Además, estudios preliminares apuntaban a una eficacia de este compuesto frente a Pseudomonas syringae pv. Tomato (Pst). En base a estos resultados los objetivos principales del presente estudio fueron, por una parte comprobar la eficacia del Hx frente a Pseudomonas y caracterizar los procesos implicados en la interacción planta-patógeno, y por otra profundizar en la implicación de la ruta del ácido jasmónico en los procesos de respuesta de la planta tanto a nivel de la respuesta basal como inducida.

    METODOLOGÍA UTILIZADA a) Condiciones de cultivo La siembra se llevó a cabo en soporte de turba mediante jiffys o bien en vermiculita (para hidroponía), las plantas se mantuvieron en cámaras de cultivo con un fotoperiodo de 16h de luz y 8h de oscuridad a 200 ¿mol m-2 s-1de intensidad lumínica, con 65% de humedad.

    b) Bioensayos con P.syringae Se realizaron ensayos con plantas de tomate de 4 semanas de edad sembradas en jiffys o mantenidas en hidroponía una semana antes del ensayo. Las plantas se trataron por riego con una concentración inductora de ácido hexanoico (0,6mM). Posteriormente, a las 72h después del tratamiento, la tercera y cuarta hoja fueron inoculadas con la cepa Pst DC3000 a una concentración de 5x105 ufc /ml. Los muestreos se realizaron en varios tiempos después de la infección.

    c) Análisis de los niveles de hormonas Los niveles hormonales fueron analizados a partir de material liofilizado, procedente de las hojas de plantas de tomate de los ensayos en varios tiempos después de la inoculación con el patógeno , por HPLC-MS.

    d) RT-qPCR La expresión de los genes marcadores fue analizada por RT-qPCR. La extracción de RNA se realizó mediante kits específicos para bacterias (Qiagen RNeasy Bacteria Mini Kit) y plantas (E:Z:N:A Plant RNA kit OMEGA biotek). Después de la cuantificación se obtuvo el cDNA y se amplificó mediante cebadores específicos para los genes de interés.

    e) Determinación de los parámetros fisiológicos Se han analizado los siguientes parámetros fisiológicos y de estrés: el contenido en clorofila y proteína total, la actividad fotosintética, la actividad peroxidasa, la actividad de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) y el contenido en el aminoácido prolina utilizando métodos previamente descritos por otros autores (Bradford, M.M, 1976; Hammerschmidt et al., 1982; Beaudoin-Eagan and Thorpe ,1985) f) Microscopia Análisis de los estomas Basándonos en trabajos anteriores (Geisler et al., 2000, Delgado et al 2011) en los que se estudiaba el desarrollo de los estomas, se ha puesto a punto un sistema de análisis de la respuesta estomática in situ. Para ello se realiza una impresión de la superficie foliar en resinas rápidas y posterior moldeado con esmalte transparente que será visualizado al microscopio óptico. Las imágenes obtenidas servirán para medir la apertura estomática usando el programa Eclipse net. Para confirmar el correcto funcionamiento del sistema antes de aplicarse a los ensayos, parte de las hojas de plantas analizadas fueron tratadas con ABA, observándose más de un 90% de estomas cerrados 1h después del tratamiento.

    Cuantificación de calosa La calosa se detectó por tinciones de azul de anilina y fue visualizada en el microscopio de epifluorescecia bajo luz UV. La cuantificación de la acumulación de calosa se hizo mediante el análisis de fotografía digital como número de píxeles relativos a la superficie cuantificada mediante el software GNU Image Manipulation Program (GIMP).

    Análisis de bacterias Viables pero no cultivables El análisis del efecto directo del Hx en las bacterias se realizó mediante control de la dinámica poblacional usando el sistema Bioscreen y mediante la tinción diferencial con naranja de acridina y SybrGreen (Live/Dead). Después de la tinción las bacterias se observaron al microscopio con luz ultravioleta.

    g) Obtención de las plantas transgénicas SlOPR3 El silenciamiento del gen OPR3 se llevó a cabo mediante un sistema basado en la obtención de RNA de doble cadena., Se extrajo ADN genomico de plantas de tomate cv Moneymaker. El fragmento de interés de 305 pb se obtuvo mediante el alineamiento de los genes OPR1, OPR2 y OPR3, escogiendo una zona de as de menor homología. Fue amplificado por PCR utilizando primers específicos que tienen en sus extremos 5¿ las secuencias de recombinación denominadas attB1 y attB2. El fragmento del gen de interés se introdujo en el vector pBin19 RNAi, en sentido y en antisentido separados por un intron. Este vector contiene el promotor constitutivo y un gen de resistencia a Kanamicina (Km) que posteriormente nos permitirá seleccionar las plantas transgénicas. A continuación se transformó Agrobacterium con la construcción.

    Para la transformación de las plantas de tomate se utilizaron cotiledones de plántulas de 7-10 días germinadas en in vitro. Se cortaron los cotiledones y se infectaron y cocultivaron con Agrobacterium que contenía el vector con la construcción en medio MS durante 3 días. Para inducir la formación de callo y tallo, los cotiledones se pasaron, al cabo de los 3 días a medio de inducción de tallo selectivo que contenia Km.

    Los explantes se subcultivaron cada 2 semanas en el medio selectivo hasta que los brotes alcanzaron un tamaño de 2 cm, momento en el que se transfirieron a medio de enraizamiento.

    Tras el enraizamiento se transfirieron a macetas y se comprobó que eran transgénicas mediante PCR usando Primers específicos para el gen que daba resistencia a la Km, obteniendo de esta manera la generación T0. El nivel de silenciamiento se comprobó por herida, seleccionándose las dos líneas de mayor nivel de silenciamiento La generación T1 se obtuvo a través de las semillas de estas plantas. En la generación T1 se seleccionaron las plantas homocigotas para el gen de interés en medio con Km. La selección de las homocigotas se realizó teniendo en cuenta el crecimiento de las raíces, ya que las que no eran resistentes a Km no desarrollaban correctamente las raíces y el crecimiento se paraba a nivel de los cotiledones. Para estudios posteriores se seleccionaron dos líneas homocigotas que se denominaron L1, L2.

    RESULTADOS Y DISCUSIÓN Es conocido que la planta utiliza la ruta de respuesta del ácido salicílico (SA) frente a P.syringae y que a su vez, dentro de la coevolución del patosistema, la bacteria es capaz de manipular la respuesta de la planta activando la ruta del ácido jasmónico (JA), antagonista del SA, mediante Jasmonato isoleucina (JA-Ile).

    En las plantas de tomate el Hx induce las rutas del SA y JA, mediante el aumento de la expresión de genes de respuesta al SA, de algunos de los genes de la ruta de síntesis y de respuesta del JA, así como la acumulación de OPDA. Es importante señalar que en las plantas tratadas, se ha producido una disminución de los niveles de JA-Ile, molécula bioactiva responsable del antagonismo entre las rutas del SA y JA. Estos resultados, junto con los encontrados por otros autores apoyan que, a pesar de que ambas rutas son antagonistas, éstas pueden llegar a ser sinérgicas, dependiendo de las estrategias de cada especie vegetal y su relación con el patógeno, lo cual explicaría el efecto protector del tratamiento frente al control de la enfermedad, aun activando ambas rutas. Además, los resultados obtenidos apoyan que el OPDA por sí mismo podría tener un papel relevante tanto en la defensa basal como en la resistencia inducida causada por el Hx, como se ha demostrado previamente frente a necrótrofos (Vicedo et al 2009).

    Por otro lado, el uso de mutantes deficientes en la producción de coronatina (COR) ha permitido demostrar que otro de los mecanismos implicados en la resistencia inducida causada por Hx, es la inhibición de COR, al no observar ninguna respuesta de los mutantes frente al Hx. Esta inhibición, podría explicar parte de la eficacia del tratamiento, ya que es conocido que COR abre los estomas lo que permite la entrada de la bacteria en el apoplasto e inhibe la ruta de respuesta del SA al actuar como análogo del JA-Ile.

    La activación de un mecanismo de resistencia puede producir en la planta la disminución de los parámetros del desarrollo con el correspondiente gasto energético. Por ello, se planteó si la inducción de la resistencia causada por Hx, podría producir una reducción del crecimiento y producción de frutos en las plantas de tomate. La realización de ensayos en plantas adultas ha permitido comprobar que el tratamiento no afecta la producción y que el mecanismo de ¿priming¿ no le supone a la planta ningún coste energético. Además se observa que en planta joven se estimulan factores fisiológicos lo que conlleva a un mejor desarrollo de la planta.

    Para poder comprender el efecto de tratamiento sobre la bacteria se ha estudiado la respuesta del patógeno frente al Hx, tanto en condiciones de cultivo in vitro como en planta. Al analizar el comportamiento de la bacteria en presencia de distintas concentraciones de Hx se demuestra que el efecto es limitado y no afecta la bacteria a concentraciones inferiores a 10mM. Sin embargo, en planta, se observa una respuesta significativa de la bacteria a los cambios provocados por el Hx en el mecanismo de inducción de resistencia. Curiosamente, al analizar la expresión de genes implicados en la patogénesis en bacterias procedentes de plantas tratadas y sin tratar con Hx, en los tiempos en los que se había visto respuesta de la planta, se ha observado un cambio a nivel trascriptómico importante, destacando una disminución de la expresión de los genes de síntesis de la COR y los genes del sistema III involucrados en la patogénesis. Estos resultados, junto con los obtenidos en el análisis de la dinámica poblacional indican que la respuesta de la planta inhibe los mecanismos de ataque de P. syringae. Así, la bacteria no puede obtener nutrientes para crecer en el apoplasto lo que se traduce en una disminución de la concentración de la bacteria y con ello, a una reducción de los síntomas en la planta. La reducción del tamaño poblacional puede llegar a niveles no detectables a largo plazo.

    Debido a que el sistema planta-patógeno sigue unos mecanismos que dependen de la coevolución de los procesos de defensa de la especie vegetal y los de ataque de un determinado patógeno, en muchas ocasiones los resultados obtenidos en una especie no son aplicables a otra, por lo que es imprescindible trabajar en esa especie en concreto. Por ello, y basándonos en las observaciones anteriores que apuntaban a un posible papel del OPDA por si mismo, no sólo como intermediario de la ruta del JA, se ha abordado el silenciamiento del gen OPR3 en tomate, usando un sistema basado en la obtención de RNA de doble cadena, obteniéndose dos líneas transgénicas provenientes de dos eventos de transformación independientes.

    El análisis transcriptómico, así como el contenido hormonal de las plantas SiOPR3 infectadas con B. cinerea, han demostrado la efectividad del silenciamiento; pero además, apuntan a la posibilidad de que el gen OPR3 podría actuar como un regulador de la ruta de síntesis y de señalización del JA. Además, se ha demostrado una interacción entre la ruta del JA y la deposición de calosa frente a B. cinerea. Tratamientos posteriores con JA y OPDA parecen demostrar un papel claramente diferenciado del OPDA, sobre todo a nivel del control de la deposición de calosa en la pared celular, mecanismo de refuerzo que se conoce que utiliza eficazmente la planta frente a necrótrofos.

    Por tanto esta tesis ha permitido estudiar los mecanismos involucrados en la resistencia inducida por el ácido hexanoico en plantas de tomate frente a P. syringae bajo dos enfoques claramente distintos pero interdependientes: el del hospedador y el del patógeno. Trabajos anteriores sobre la inducción de resistencia se han centrado principalmente en la respuesta de la planta, por ello el estudio del comportamiento del patógeno durante el proceso, podría ayudar a comprender de forma integrada el proceso desencadenado por la aplicación del tratamiento, y con ello poder potenciarlo o adaptarlo a los procesos evolutivos del sistema planta-patógeno. Por otra parte, ha permitido obtener dos líneas de plantas silenciadas para el gen OPR3 que podrán servir como herramientas de estudio de la ruta de respuesta del JA en tomate. Con el uso de estos mutantes se ha podido establecer el papel del OPDA como molécula activa en la resistencia frente B. cinerea, y permitirá esclarecer el papel de esta molécula en los mecanismos de inducción de resistencia.

    BIBLIOGRAFÍA 1. Beaudoin-Eagan, L.D. and Thorpe, T.A. (1985) Tyrosine and Phenylalanine Ammonia Lyase Activities during Shoot Initiation in Tobacco Callus Cultures. Plant Physiol. 78(3), 438-41.

    2. Bradford, M.M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 72, 248-254.

    3. Delgado, D., Alonso-Blanco C., Fenoll, C. and Mena, M. (2011) Natural variation in stomatal abundance of Arabidopsis thaliana includes cryptic diversity for different developmental proceses. Ann. Bot. 107 (8), 1247-1258.

    4. Geisler, M., Nadeau, J. and Sack, F.D. (2000) Oriented asymmetric divisions that generate the stomatal spacing pattern in Arabidopsis are disrupted by the too many mouths mutation. Plant Cell. 12, 2075¿2086.

    5. Hammerschmidt R., Nuckles, E.M. and Kuc, J. (1982) Association of enhanced peroxidase activity with induced systemic resistance of cucumber to Colletotrichum lagenarium. Physiol Plant Pathol. 20, 73¿82.

    6. Vicedo, B., Flors, V., Leyva, M.D., Finiti, I., Kravchuk, Z., Real, M.D., García-Agustín, P. and González-Bosch C. (2009) Hexanoic Acid-Induced Resistance against Botrytis cinerea in Tomato Plants. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 1455-1465.