Impacto de la obesidad y el cáncer sobre el potencial terapéutico de las células troncales mesenquimales humanas derivadas de tejido adiposo
- Autores: Alejandro Villagrasa Vizcaíno
- Directores de la Tesis: Damián García Olmo (dir. tes.), Mariano Andrés García Arranz (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina y Cirugía por la Universidad Autónoma de Madrid
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
Introducción. La obesidad y el cáncer son patologías cuyos pacientes suelen presentar un proceso de cicatrización alterado. La obesidad está definida como una acumulación excesiva de grasa que puede comprometer el estado de salud y, de hecho, la mayoría de los pacientes presentan otras enfermedades asociadas como diabetes mellitus, riesgo cardiovascular y/o deficiencias nutricionales. Todo ello puede ser un importante factor de riesgo para el proceso de cicatrización. El cáncer es una enfermedad genética que presenta numerosas comorbilidades y mortalidad. Además, diversos tratamientos como la cirugía, la quimioterapia y/o radioterapia pueden comprometer el proceso de cicatrización de los tejidos implicados. En estos casos, la mayoría de las heridas suelen quedar arrestadas en una fase inflamatoria y los tratamientos actuales parecen ser poco satisfactorios. En los últimos años las terapias basadas en células madre han aparecido como una alternativa terapéutica prometedora, y concretamente, las ASCs (células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo) presentan el principal foco de atención ya que son relativamente fáciles de obtener, son abundantes en el organismo, presentan una demostrada actividad regeneradora e inmunomoduladora, tienen efecto antiséptico y son seguras y sencillas de cultivar in vitro.
Objetivo. El objetivo general de este estudio es evaluar el impacto que presenta la obesidad y el cáncer sobre el potencial terapéutico de las ASCs, bien sobre las ASCs residentes o bien el impacto que el microambiente patológico puede generar sobre las ASCs. Los pacientes obesos y oncológicos presentan una importante incidencia de desarrollar heridas crónicas y podrían ser buenos candidatos para un trasplante de células madre, pero para ello es importante decidir entre un trasplante autólogo o alogénico dependiendo del potencial terapéutico de sus células.
Métodos. Las ASCs fueron aisladas a partir de muestras de tejido adiposo subcutáneo de pacientes control (n=14), pacientes obesos (n=21) y pacientes oncológicos (n=22). Las células obtenidas se expandieron in vitro y se caracterizaron siguiendo las indicaciones de la ISCT y la IFATS de acuerdo con la expresión de antígenos de superficie y a su capacidad de diferenciación hacia otros linajes celulares. Se evaluó el potencial terapéutico de acuerdo con su fenotipo, proliferación, diferenciación, capacidad de cicatrización in vitro y secreción de mediadores inmunomoduladores. También se quiso conocer el efecto del plasma de los pacientes obesos y oncológicos sobre la capacidad de cicatrización y proliferación de las ASCs. Para determinar el fenotipo celular y verificar el estatus de célula troncal mesenquimal se realizó un análisis por citometría de flujo para los siguientes anticuerpos: CD90, CD73, CD29, CD45, CD34 y HLA-DR. La capacidad de diferenciación se evaluó sometiendo las diferentes líneas celulares hacia linaje adipogénico y osteogénico y posteriormente midiendo por absorbancia los colorantes ORO y ARS respectivamente. Para el ensayo de viabilidad/proliferación se empleó el kit alamarBlue® cuyo reactivo puede ser metabolizado por las células y su cambio de color es indicativo de la proliferación y capacidad metabólica del cultivo celular. La cicatrización se evaluó siguiendo el modelo de “wound healing scratch assay”, en el cual la monocapa del cultivo celular es dañada generando un área hacia donde las células puedan migrar y posteriormente se mide el porcentaje de área que permanece sin cerrarse a tiempos concretos. El perfil proinflamatorio, tanto del secretoma celular como del plasma de los diferentes donantes, se analizó con el kit MILLIPLEX® MAP Human High Sensitivity T Cell Magnetic Bead Panel para las diferentes citoquinas y quimioquinas: Fractalkine, GM-CSF, IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17A, IL-21, IL-23, ITAC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α y TNFα. En el ensayo in vivo se evaluó el impacto del plasma de los diferentes pacientes a partir de heridas generadas a nivel cutáneo en ratones obesos ob/ob.
Resultados y discusión. Las poblaciones celulares aisladas a partir de las muestras de tejido adiposo expresaron los marcadores típicos del estroma CD90, CD73, CD29 y no presentaron el antígeno HLA-DR del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II ni los marcadores de linaje hematopoyético CD45 y CD34. Si bien las líneas de pacientes control presentaron un marcaje muy definido, no se observó lo mismo en las ASCs de los pacientes obesos y oncológicos, mostrando menor nivel de expresión de CD29 y CD73. Para completar la caracterización se confirmó su capacidad de diferenciarse hacia linaje osteogénico y adipogénico, pero las ASCs del grupo obesidad durante la diferenciación adipogénica no mostraron diferencias significativas con respecto a los controles negativos. Se observó el mismo efecto en las ASCs del grupo oncológico para la diferenciación osteogénica. Los datos de la expresión de antígenos de superficie unida a la diferenciación de las líneas celulares podrían hacernos pensar que existe cierta pérdida del fenotipo de las ASCs que provienen de pacientes obesos y oncológicos, indicando que ambas tienen un perfil levemente comprometido.
En el ensayo de cicatrización en el que se testaron las células de los diferentes pacientes no se observaron diferencias significativas entre los grupos para el porcentaje del área de herida a las 48h. Sin embargo, cuando se tratan ASCs de donante sano con el plasma de los pacientes obesos el área de herida es menor a las 48h ya que muchas más células han migrado hacia la región dañada. La obesidad se considera un estado proinflamatorio en el que numerosas citoquinas y mediadores inmunológicos son liberados a nivel local y sistémico desde el tejido adiposo inflamado. Nuestra intención al recoger la sangre de los pacientes era simular ese ambiente in vitro y pensamos que el cóctel de citoquinas encontrado en el estudio del perfil proinflamatorio podría estar estimulando los mecanismos de migración celular ya que diversos estudios sugieren que los niveles elevados de citoquinas tanto en el tejido adiposo como en sangre podría tener efectos oncogénicos favoreciendo la motilidad celular, la invasión, la transición epitelio-mesenquimal y la metástasis.
El análisis de viabilidad/proliferación celular mediante el ensayo de alamarBlue® mostró un perfil similar en todos los cultivos de los diferentes donantes no pudiéndose establecer diferencias entre los grupos. Tampoco se observaron diferencias cuando las ASCs de donante sano fueron tratadas con el plasma de los diferentes pacientes.
El análisis del perfil proinflamatorio mostró que los pacientes obesos tenían mayor concentración de las siguientes citoquinas con respecto a los pacientes control: IL-10, IL-2, IL-21, IL-23, IL-6, IL-7 y TNF-α. Sin embargo, los pacientes oncológicos presentaron niveles más elevados para MIP-3α, IL-6 e IL-8. El análisis del secretoma de las diferentes líneas mostró algunas diferencias, no obstante, no podemos obtener unos resultados concluyentes debido a la gran variabilidad intragrupo observada, por lo que no podemos establecer que la obesidad o el cáncer pueda estar modificando los patrones de secreción de citoquinas en las ASCs.
El estudio histológico de las heridas tratadas con el plasma de los pacientes obesos muestra un retraso en el proceso de cicatrización, y, además, cursan con inflamación aguda tanto a los 3 días como a los 9 días de análisis. El tejido conjuntivo es laxo y con poca presencia de fibroblastos. Los tratamientos realizados con el plasma de donante sano presentan una cicatrización acelerada con respecto a los controles sin gel ya que se observa un tejido de granulación muy formado y el área de las heridas es menor. Las heridas tratadas con el plasma de los pacientes con cáncer cursan con inflamación aguda y presentan tejido conjuntivo laxo con abundantes neutrófilos y escasos fibroblastos a los 3 días, pero a los 9 días ya se observa mayor cantidad de tejido de granulación.
Conclusiones. En este trabajo hemos demostrado que la obesidad y el cáncer están modificando la multipotencialidad de las ASCs para diferenciarse hacia linaje adipogénico y osteogénico y, además, está alterando en parte, los niveles expresión de antígenos de superficie que podría estar asociado con una pérdida del fenotipo celular. Estos resultados, unidos al efecto que tiene el plasma de alterar la migración observada in vitro y el proceso de cicatrización en el ensayo in vivo junto con los datos obtenidos en el estudio del perfil proinflamatorio, nos permite sugerir que sería más adecuado el uso de células troncales mesenquimales alogénicas en caso de tratamiento para pacientes obesos y/u oncológicos debido a sus propiedades inmunomoduladoras. Por otro lado, consideramos que el tratamiento con células troncales mesenquimales y plasma sano mejora el proceso de cicatrización y puede prevenir que las heridas se cronifiquen. Sin embargo, consideramos que son necesarios más estudios para profundizar y entender cómo estas patologías son capaces de alterar el comportamiento de este tipo celular.
