Resumen de Marcaje por fotoafinidad del centro de interaccion de purinas de la ribonucleasa a
La caracterizacion de los centros de interaccion enzima-sustrato y la contribucion de aminoacidos especificos en la formacion del complejo enzima-sustrato son aspectos clave en el conocimiento de la catalisis de una enzima. El objetivo general de este trabajo se centra en analizar la funcion del centro de interaccion de purinas (b2r2) en el proceso de catalisis de la ribonucleasa a (rnaasa a). Con el fin de modificar de forma especifica esta region se ha utilizado como marcador el nucleotido fotoactivable 8- azidoadenosima 5'-monofosfato (8n3-amp), un analogo del 5'-amp. De acuerdo con el modelo de interaccion enzima- sustrato de la rnaasa a, se puede hipotetizar que la interaccion primaria el grupo fosfato del marcador se dirigiria al centro principal de fijacion de fosfato o centro activo (p1) y la region nucleosidica al centro de interaccion de purinas (b2r2). El proceso de fotoactivacion del grupo azido generara la union covalente del nucleotido a la enzima y, por tanto, se obtendra una (s) forma (s) de la enzima en la que el centro b2r2 estara ocupado de una manera analoga a la que se produce en la interaccion enzima-sustrato, pero estabilizada por la union covalente. El trabajo se ha organizado en una serie de objetivos concretos: 1) estudio de la reaccion de marcaje de fotoafinidad. -determinacion de las condiciones optimas de reaccion: -la separacion de los productos de reaccion de la rnaasa a con el 8n3-amp por diferentes metodos cromatograficos y la caracterizacion preliminar de las fracciones modificadas ha indicado que la reaccion genera una monosustitucion en la enzima. 2) estudios sobre la localizacion del nucleotido marcador en la rnaasa a. 3) localizacion de la (s) posicion (ones) de union del nucleotido marcador. 4) el analisis de las curvas de titracion de los residuos de his (his-12 y his-119) obtenidas por espectroscopia de 1h-rmn ha indicado que en las dos subfracciones el grupo fosfato de
