Estudio de la Hematopoyesis y Megacariopoyesis humana a partir de células madre pluripotentes humanas. Generación de modelos humanos de enfermedad asociados a trastornos plaquetarios raros
- Autores: María del Mar Bonillo Lamolda
- Directores de la Tesis: Pedro José Real Luna (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Consolación Melguizo (presid.), José Carlos Prados Salazar (secret.), Juan Roberto Rodríguez Madoz (voc.), José Antonio Guerrero López (voc.), Alessandra Giorgetti (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Granada
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
Históricamente, el estudio de la biología del desarrollo se ha efectuado en organismos modelos clásicos. Recientemente, las células madre pluripotentes humanas (hPSC), que incluyen tanto a las células madre embrionarias humanas (hESC) como a las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), han surgido como un nuevo modelo ofreciendo ventajas únicas para los estudios del desarrollo. Las hPSC pueden recapitular aspectos del desarrollo embrionario humano a la vez que mantienen la capacidad de defirenciarse a cualquier linaje celular del organismo humano. Además, las hPSC suponen un potente recurso en medicina regenerativa como fuente potencial de células maduras funcionales capaces de reconstituir órganos o tejidos en individuos con distintas patologías. Hasta ahora, los ensayos clínicos realizados con hPSC han mostrado resultados prometedores. El campo de la medicina regenerativa también aborda la terapia génica en hPSC como tratamiento de enfermedades genéticas mediante la edición génica de las células del paciente. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes es la falta de funcionalidad de algunos tipos celulares obtenidos a partir de hPSC, como las células madre hematopoyéticas (HSC). Por ello es necesario seguir avanzando en esta área de investigación.
La hematopoyesis es un proceso complejo que se inicia durante el desarrollo embrionario temprano y será responsable de originar todas las células hematopoyéticas del individuo a lo largo de su vida. La hematopoyesis embrionaria se divide en dos etapas: la hematopoyesis primitiva y definitiva. La primera etapa se compone de la oleada 1 originando eritrocitos, macrófagos y megacariocitos primitivos que permiten la oxigenación del embrión y su crecimiento. La segunda etapa está constituida por la oleada 2, que produce progenitores eritro-mieloides y linfoides multipotentes con características fetales y adultas, y por la oleada 3 que genera las HSC que migran al hígado fetal y posteriormente a la medula ósea donde permanecen de por vida sosteniendo al sistema hematopoyético adulto. La regulación espacio-temporal de la hematopoyesis está controlada por diversos factores de transcripción. Uno de los más importantes es RUNX1, cuya expresión está controlada por dos promotores y depende del splicing alternativo de sus exones que produce numerosas isoformas, de las cuales las 3 más estudiadas son RUNX1a, RUNX1b y RUNX1c. La función de cada isoforma no está bien definida, especialmente en humanos. Nuestro primer objetivo es estudiar la función de las isoformas de RUNX1 en la hematopoyesis humana usando hPSC como modelo biológico. En primer lugar generamos líneas hiPSC que sobre-expresan las isoformas de RUNX1 y examinamos su efecto en la diferenciación hematopoyética in vitro. Observamos que RUNX1a incrementa la fomación de progenitores hemato-endoteliales (HEP) y hematopoyéticos CD41a+CD45+ durante la diferenciación, mientras que la obtención de progenitores megacariociticos-eritroides (MEP) CD41a+CD235a+ sólo se detectó a días tempranos de la diferenciación. En cambio, RUNX1b y RUNX1c aumentan la generación de HEP y progenitores CD41a+CD45+ a días tempranos de la diferenciación. Además, RUNX1b reduce la generación de progenitores MEP y RUNX1c promueve su formación a días tempranos de la diferenciación. A continuación, estudiamos la capacidad clonogénica de las diferentes isoformas y observamos que RUNX1a presenta un potencial clonogénico menor al control, mientras que RUNX1b no es capaz de originar colonias hematopoyéticas. Por el contrario, RUNX1c presenta un aumento de la capacidad clonogénica. Estos resultados indican que las isoformas de RUNX1 poseen diferentes funciones durante la hematopoyesis de hiPSC, siendo RUNX1a y RUNX1c las isoformas de mayor relevancia durante la diferenciación hematopoyética.
Las transfusiones de plaquetas son esenciales para tratar a pacientes con trombocitopenias que muestran un descenso del número de plaquetas circulantes en el torrente sanguíneo. Actualmente, la sangre periférica de donantes sanos es la única fuente de plaquetas en clínica. Idealmente, podríamos usar plaquetas funcionales generadas in vitro a partir de HSC derivadas del paciente, pero el problema radica en que el cultivo y la expansión ex vivo de HSC es muy limitado. Una alternativa más eficiente, sería el uso de hPSC como fuente constante de plaquetas para uso clínico. Aunque se han logrado algunos avances en este campo, la producción de plaquetas a partir de hPSC sigue siendo ineficiente y se requieren protocolos más efectivos. Reproducir las condiciones fisiológicas del nicho de la médula ósea podría potenciar la generación de megacariocitos y plaquetas derivadas de hPSC. El crecimiento y la formación de los megacariocitos ocurren en el nicho osteoblástico a bajas concentraciones de O2, mientras que la maduración de los megacariocitos ocurre en el nicho vascular a una mayor concentración de O2, donde se liberan las plaquetas. Nuestro segundo objetivo consiste en analizar el papel de la hipoxia en la megacariopoyesis de hPSC. Para realizar estos estudios, llevamos a cabo la diferenciación a megacariocitos de hPSC, empleando diferentes condiciones de O2 (2% O2 y 5% O2). Nuestros resultados demuestran que la hipoxia reduce la viabilidad celular de las hPSC seleccionando los progenitores hematopoyéticos CD34+ de mayor potencial megacariopoyético. Cabe destacar que la condición fisiológica (2% O2- 5% O2) incrementa el número de megacariocitos y de plaquetas CD41a+CD42b+ derivados de hPSC. Además, nuestro grupo demostró que la expresión ectópica de SCL potenciaba la megacariopoyesis de hPSC. Por tanto, combinamos el efecto de la hipoxia y la sobre-expresión de SCL para estudiar la megacariopoyesis de hPSC. En contraste a nuestra hipótesis de partida, la hipoxia reduce la producción de megacariocitos en hPSC que sobre-expresan SCL. Análisis moleculares más detallados demostraron que las condiciones hipóxicas aceleran la degradación de SCL por el proteosoma mediado por su fosforilación a través de MAPK. Estos resultados nos permiten ampliar nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares que controlan la megacariopoyesis humana a partir de hPSC, así como la mejora de los protocolos actuales de diferenciación megacariocítica.
Históricamente, el empleo de hiPSC se ha basado en la generación in vitro de modelos humanos de enfermedad. Por tanto, disponemos de un modelo ideal para estudiar los aspectos moleculares y funcionales implicados en el desarrollo de enfermedades, además de poder desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. El trastorno plaquetario familiar con neoplasia mieloide asociada (FPDMM) es una enfermedad plaquetaria rara, causada por mutaciones en el gen RUNX1 y caracterizada por presentar trombocitopenia, función plaquetaria anormal y un mayor riesgo de desarrollar otros trastornos sanguíneos o cánceres. Proponemos generar un modelo humano de FPDMM con una mutación no reportada en el exón 6 de RUNX1. Generamos una línea hiPSC mediante la reprogramación celular de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una paciente con FPDMM, empleando virus Sendai no integrativos que expresan los factores de reprogramación de Yamanaka. Mediante análisis funcionales y genéticos completamos la caracterización de la nueva línea celular hiPSC. En primer lugar, se confirmó la presencia de la mutación en RUNX1 por secuenciación Sanger. Análisis de polimorfismos (STR) demostraron la identidad genética entre las PBMC de la paciente y la línea celular hiPSC. Mediante RT-PCR se comprobó el silenciamiento de los genes exógenos de reprogramación y la activación de los genes endógenos de pluripotencia. Además, la expresión de marcadores de pluripotencia se demostró por citometría de flujo. La línea hiPSC mostró un cariotipo normal y actividad positiva para fosfatasa alcalina. Finalmente, para comprobar la capacidad de diferenciación a las tres capas germinales del embrión de la nueva línea hiPSC, se realizaron ensayos funcionales de formación de cuerpos embrionarios y formación de teratomas. En ambos casos, se demostraron estructuras específicas de endodermo (epitelio ciliado), mesodermo (cartílago) y ectodermo (rosetas neurales). Además, también detectamos la expresión de marcadores representativos de las tres capas germinales. La generación de esta línea representa una gran herramienta para estudiar la biología de esta enfermedad, y además nos permite aplicar nuevas terapias para el tratamiento de FPDMM, como la corrección fenotípica mediante terapia génica o ensayo de nuevos fármacos.
Finalmente, nuestro laboratorio había generado varios modelos celulares del Síndrome de Bernard-Soulier (BSS) deficientes en GP9. Esta enfermedad es un trastorno plaquetario monogénico poco frecuente, causado por la deficiencia congénita del complejo glicoproteico GPIb-IX-V debido a mutaciones en GP1BA, GP1BB o GP9 y caracterizado por macrotrombocitopenia y sangrados severos. Nuestro último objetivo se centró en validar uno de estos modelos de enfermedad y su correspondiente línea hiPSC rescatada por terapia génica lentiviral mediante la expresión del gen silvestre GP9. Realizamos la diferenciación megacariocítica de las líneas hiPSC generadas. Observamos que ambas líneas producen progenitores hematopoyéticos CD34+, progenitores megacariocíticos CD34+CD41a+ y células CD41a+, de forma similar. Durante la evaluación de la diferenciación megacariocítica terminal de estos precursores, confirmamos que las células no rescatadas son incapaces de progresar y generar megacariocitos maduros CD42a+ y CD41a+CD42a+. Sin embargo, y de forma destacada las células rescatadas son capaces de progresar y madurar hasta megacariocitos maduros CD41a+CD42a+. Estos resultados muestran que la terapia génica ha sido eficiente al restaurar la expresión de GPIX en la membrana de los megacariocitos y además puede convertirse en una aproximación terapéutica en un futuro próximo para pacientes con BSS que presentan mutaciones en GP9.
Developmental biology has long benefited from classical model organisms studies. Recently, human pluripotent stem cells (hPSC), including human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC), have emerged as a new model system that offers unique advantages for developmental studies. hPSC are able to recapitulate aspects of embryonic development while maintaining the ability to become any cell lineage in the human body. In addition, hPSC are very useful in regenerative medicine as a potential source of functional mature cells to reconstitute organs or tissues in individuals with different pathologies. So far, hPSC have been included in clinical trials with promising results. The regenerative medicine field also includes gene therapy in hPSC as a treatment for genetic diseases based on gene editing of the patients’ cells. However, one of the main problems is the lack of functionality of some cell types obtained from hPSC, such as hematopoietic stem cells (HSC). Therefore it is necessary to continue advancing in this research area.
Hematopoiesis is a complex process that begins during early embryonic development and will be responsible to originate all hematopoietic cells of the individual throughout his entire life. Embryonic hematopoiesis is divided into two stages: primitive and definitive hematopoiesis. The first stage contains “wave 1” that generates primitive erythrocytes, macrophages and megakaryocytes that allow embryo oxygenation and growth. The second stage constituted by ”wave 2”, which produces erythro-myeloid and multipotent lymphoid progenitors with fetal and adult characteristics, and by “wave 3” consisted on HSC migration to the fetal liver and subsequently to the bone marrow where they remain for life maintaining the whole adult hematopoietic system. The spatio-temporal regulation of hematopoiesis is controlled by several transcription factors. One of the most important is RUNX1, whose expression is regulated by two alternative promoters and depends on alternative splicing of its exons producing numerous isoforms. From them RUNX1a, RUNX1b and RUNX1c are the 3 most studied. The function of each isoform is not well defined yet, especially in humans. Our first objective is to study the function of RUNX1 isoforms in human hematopoiesis using hPSC as a biological model. First, we generated hiPSC lines overexpressing RUNX1 isoforms and examined their effect on hematopoietic differentiation in vitro. We observed that RUNX1a increases the production of hemato-endothelial progenitors (HEP) and CD41a+CD45+ hematopoietic progenitors during differentiation, while the generation of CD41a+CD235a+ megakaryocytic-erythroid progenitors (MEP) was only detected at early days of differentiation. In contrast, RUNX1b and RUNX1c isoforms increased the generation of HEP and CD41a+CD45+ progenitors at early days of differentiation. Besides, RUNX1b reduced the generation of MEP, while RUNX1c promoted MEP formation at early days of differentiation. Next, we studied the clonogenic capacity of the different isoforms and we observed that RUNX1a has a lower clonogenic potential compared to wild type cells, while RUNX1b was not capable to produce hematopoietic colonies. In contrast, RUNX1c presented an increase in the clonogenic capacity. These results indicate that RUNX1 isoforms have different functions during human embryonic hematopoiesis, being RUNX1a and RUNX1c the most relevant isoforms during hematopoietic differentiation.
Platelet transfusions are essential to treat patients with thrombocytopenias who show a decrease in the number of circulating platelets in the bloodstream. Nowadays, peripheral blood from healthy donors is the only source of platelets in clinic. Ideally, we could use functional platelets generated in vitro from HSC derived from the patient, but the problem is that the ex vivo culture and expansion of HSC is very limited. hPSC become a more efficient alternative that could be used as a continuous source of platelets for clinical use. Although there have been some advances in this field, platelet production from hPSC remains inefficient and more effective protocols are required. Mimicking physiological conditions of the bone marrow niche can be a helpful improvement. The growth and formation of megakaryocytes occurs in the osteoblastic niche at low O2 concentrations, while megakaryocytic maturation occurs in the vascular niche at a higher O2 concentration, where platelets are released. Our second aim will be to study the role of hypoxia in megakaryopoiesis from hPSC. To complete these studies we performed megakaryocyte differentiation at different O2 conditions (2% O2 and 5% O2). Our results demonstrated that hypoxia reduces the cellular viability of hPSC by selecting CD34+ hematopoietic progenitors with the highest megakaryopoietic potential. Importantly, the physiological condition (2% O2- 5% O2) increases the number of both CD41a+CD42b+ megakaryocytes and platelets derived from hPSC. Moreover, our group showed that SCL-overexpression potentiated megakaryopoiesis from hPSC. So, we combined the effects of hypoxia and SCL over-expression to study megakaryopoiesis of hPSC. In contrast to our original hypothesis, hypoxia reduced megakaryocyte production in SCL-overexpressing hPSC. A more detailed molecular analysis showed that SCL is degraded under hypoxic conditions by the proteasome in a MAPK-dependent manner. These results allow us to increase our understanding of the molecular mechanisms controlling human megakaryopoiesis from hPSC, as well as the improvement of current megakaryocyte differentiation protocols.
hiPSC have been historically used to generate human disease models in a dish. In that way, we will have an ideal model to study molecular and functional aspects of the diseases and also it will help us to develop new therapeutic approaches. Familial platelet disorder with associated myeloid malignancy (FPDMM) is a rare platelet disorder caused by mutations in RUNX1 gene, characterized by thrombocytopenia, abnormal platelet function and an increased risk of developing other blood disorders or cancers. We propose to generate a human FPDMM model with a non-previously reported mutation in exon 6 of RUNX1. We generated a hiPSC line by cellular reprogramming of PBMC from a FPDMM patient using non-integrative Sendai viruses expressing Yamanaka reprogramming factors. Through functional and genetic analyses we completed the characterization of the new hiPSC cell line. First, the presence of the RUNX1 mutation was confirmed by Sanger sequencing. STR analysis demonstrated the genetic identity between the original mononuclear cells from the patient and the hiPSC cell line. RT-PCR verified the silencing of exogenous reprogramming genes and the activation of endogenous pluripotency genes. Also, the expression of surface pluripotency markers was demonstrated by flow cytometry. The new hiPSC line showed a normal karyotype and positive activity for alkaline phosphatase. Finally, to demonstrate the capacity of hiPSC line to differentiate into the three germ layers in vitro and in vivo, embryoid bodies and teratoma formation assays were accomplished. In both cases, specific structures from endoderm (ciliated epithelium), mesoderm (cartilage) and ectoderm (neural rosettes) were demostrated. Besides, we also detected the expression of representative markers of the three germ layers. The generation of this line represents a great tool to study the biology of this disease, and also allows us to apply new therapies for the treatment of FPDMM, such as phenotypic correction by gene therapy or testing of new drugs.
Finally, our laboratory had generated several models of Bernard-Soulier syndrome (BSS) deficient in GP9. This disease is a rare monogenic platelet disorder caused by congenital deficiency of the GPIb-IX-V glycoprotein complex due to mutations in GP1BA, GP1BB or GP9 and characterized by macrochrombocytopenia and severe bleeding. Our last aim was to validate one of this disease model and its corresponding rescued hiPSC cell line, in which GP9 wildtype gene was introduced by lentiviral vectors. We performed the megakaryocytic differentiation in both hiPSC lines. We observed that both produced CD34+ hematopoietic progenitors, CD34+CD41a+ megakaryocyte progenitors and CD41a+ cells, in a similar way. Interestingly, during the evaluation of the terminal megakaryocytic differentiation of these precursors, we confirmed that the original non-rescued hiPSC cells were unable to progress and to generate CD42a+ and CD41a+CD42a+ mature megakaryocytic cells. However, GP9-rescued cells were able to progress and produced mature megakaryocytes. These results show that gene therapy has been efficient to restore GPIX expression on megakaryocytes’ surface and can also become a therapeutic approach for patients with BSS carrying GP9 mutations in the next future.
