Resumen de Ingenieria de la proteina beta-galactosidasa d¿escherichia coli. Aplicaciones al desarrollo de biosensores moleculares
En este trabajo se presenta el uso de la B-galactosidasa d¿Escherichia coli como proteina portadora de péptidos con actividad biologica. Con esta finalidad, se ha utilizado el lazo entre las hojas beta G y H de la proteina VP1 del virus de la fiebre aftsa como peptido funcional. Se han identificado asi 4 sitios permisivos (entre los aminoacidos 249-250,581-582,772-773 y 795-796), junto con la fusion al extremo C-terminal, y se ha comprobado al mimo tiempo que la B-galactosidasa puede tolerar hasta 3 copias del peptido por monomero.
La presencia del péptido tiene un efecto directo sobre las propiedades de la B-galactosidasa. En la mayoria de las quimeras construidas se observa una reducción en la actividad especifica, debido a cambios tanto en la afinidad or el substrato (KM) como en la velocidad de hidrólisis (Kcat).
Tamben se aprecian claras disminuciones en los valores de AG(H2O), excepto en la fusión en el extremo C-terminal. A partir de los estudios de estabilidad se ha podido determinar el proceso de desplegamiento de la B-galactosidasa, en el que se puede apreciar la presencia de un intermediario estable, pero inactivo. Las propiedades del peptido virico tambien se han visto afectadas dependiendo del lugar en donde se han realizado la inserción. Asi, se obtienen marcadas diferencias en los valores de IC50 en el reconocimiento de los epitopos presentes en el peptido por parte de anticuerpos dirigidos contra esa zona. Por otra lado, la capacidad de unión a celulas de mamiferos a traves de un motivo RGD presente en el peptido, tambien varia depediendo del lugar de insercion y del numero de copias. Finalmente, se ha observado que la union de anticuerpos al peptido virico puede incrementar la actividad de los enzimas hasta mas de un 300%, aunque tan solo aquellos que han visto reducida su actividad debido a la inserción pueden ser modulados. Esta mejora es debida tanto a una mejor afinidad por el substrato como a una mayor velo
