Nanosensores metabolicos para la identificación de metabofenotipos tumorales
- Autores: Consuelo Ripoll Lorente
- Directores de la Tesis: Ángel Orte Gutiérrez (dir. tes.), Miguel Martín Hernández (dir. tes.), María José Ruedas Rama (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Eva María Talavera Rodríguez (presid.), José Manuel Paredes Martínez (secret.), María Teresa Valero Griñán (voc.), Francisco Galindo Honrubia (voc.), Julio Montoya Villaroya (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Farmacia por la Universidad de Granada
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
Nanosensores metabólicos para la identificación de fenotipos tumoral Introducción En los últimos años se ha descubierto que el metabolismo tumoral no es un “accidente” evolutivo celular, sino un proceso finamente regulado, denominado reprogramación metabólica tumoral (RMT). Gracias a los avances en el estudio del cáncer desde la perspectiva de la RMT, se están comenzando a caracterizar, tanto los distintos tipos de tumores, como la propia evolución tumoral, mediante el establecimiento de metabofenotipos específicos. Por tanto, el diseño de las nuevas herramientas diagnósticas basadas en las propiedades metabólicas tumorales representa una estrategia de gran potencial. Las alteraciones en ruta metabólicas, asociadas con los metabofenotipos tumorales frente a no tumorales, generan alteraciones en los diferentes niveles de metabolitos, prediciendo cambios importantes en parámetros como el pH mitocondrial. Para esta Tesis se eligió el modelo de cáncer de mama, ya que según la clasificación clínica, tiene cinco subtipos con diferente perfil inmunológico. Nuestro objetivo, esta caracterizar las principales características metabólicas de cada subtipo, aplicando posteriormente nanosensores desarrollados para evaluar su potencial como herramientas de diagnóstico metabólico del cáncer.
Una de las técnicas más empleadas para la detección de analitos específicos a nivel celular es la microscopía confocal de fluorescencia, mediante el empleo de sensores fluorescente intracelulares. Como la alternativa más eficaz, se usó el tiempo de vida de fluorescencia, ya no se ve afectado por la concentración de los fluoróforos ni la potencia de la fuente de excitación. Cuando esta técnica se hibrida con la microscopía de confocal de fluorescencia, da lugar a la microscopía de tiempos de vida de fluorescencia (FLIM), que permite recomponer imágenes multidimensionales que incluyen tanto la información sobre intensidad de fluorescencia como la dimensión de tiempo de vida de fluorescencia. Para realizar los nanosensores, se utilizaron quantum dots (QDs), que son nanopartículas de 2-10 nm, con unas propiedades ópticas que los hacen óptimos para su uso como nanosensores. Los QDs tienen un tiempo de vida muy largo, lo que evita que haya interferencias con la autofluorescencia celular.
Objetivos principales 1. Desarrollo de una familia de nanosensores basados en QDs, para realizar medidas de metabolitos intracelulares usando FLIM.
2. Estudio de los perfiles metabólicos de los subtipos de cáncer de mama.
3. Análisis de los cambios de pH y su relación con los cambios en el metabolismo tumoral.
Resultados En esta Tesis, se ha desarrollado una familia de nanosensores, en la que los QDs, se modificaron usando, cyclam o cyclen, mostrando una respuesta selectiva hacia iones Zn2+. El rendimiento de estos nanosensores se probó en disolución y en el interior de células. Además, hemos desarrollado una familia de nanosensores de pH con diferentes aplicaciones en el estudio del metabolismo celular. Uno de los nanosensores se empleó en la estimación del pH del medio extracelular. El segundo nanosensor fue diseñado para penetrar en el interior celular, y medir el pH intramitocondrial, mediante imágenes FLIM.
Los nanosensores se usaron para estudiar el comportamiento metabólico de cinco líneas de cáncer de mama. Estos experimentos demostraron que las líneas celulares MCF7, ZR751 y SKBR3 poseían un pH extracelular superior al de las líneas celulares MDA-MB-231 y MDA-MB-468. Sin embargo, cuando los nanosensores fueron usados en el interior celular, la línea celular MCF7 mostraba un pH intramitocondrial más bajo que el de las líneas celulares SKBR3, MDA-MB-231 y MDA-MB-468.
Para completar estos resultados, realizamos un estudio metabólico de los subtipos de cáncer de mama. Para ello, se midió la viabilidad de las líneas celulares tras ser expuestas a una serie de inhibidores metabólicos. Tras usar el inhibidor de la transaminasa AOA, obtuvimos una primera clasificación metabólica basada en la dependencia de las líneas celulares de los metabolitos aspartato y piruvato y, por tanto, se estableció la importancia del equilibrio redox para su metabolismo. Para conocer si el metabolismo de las líneas celulares era glucolítico o dependía del metabolismo mitocondrial usamos BAM15, un desacoplante de membrana mitocondrial, así se conocía la dependencia de las líneas celulares a ATP. Las líneas culares triple negativas (MDA-MB-231 y MDA-MB-468) y SKBR3 resultaron sensibles a esta inhibición. La dependencia a NAD+ y a la glucolisis se comprobó usando los inhibidores fenformina y Akt, respectivamente. Para ambos inhibidores, la líneas celulares MCF7, ZR751 y SKBR3 fueron sensibles.
Con estos resultados, pudimos estableces claramente que las líneas celulares MCF7 y ZR751 tienen un metabolismo dependiente de la glucolisis. Sin embargo las líneas celulares triple negativas muestran un perfil dependiente del metabolismo mitocondrial. Finalmente, la línea celular SKBR3 presenta un metabolismo que comparte algunas características comunes entre los otros do metabofenotipos.
Finalmente, se correlacionaron las diferencias de pH encontradas entre las líneas celulares de cáncer de mama utilizando nanosensores basado en QDs con la clasificación metabólica propuesta en este trabajo. Cuando se analizan los resultados conjuntamente, se puede sugerir, que hay dos perfiles claramente diferenciados: el compuesto por la líneas celulares triple negativas y el del MCF7y posiblemente ZR751 (los intentos de introducir el nanosensor intramitocondrial en estas células no tuvieron éxito).
Estos resultados están perfectamente en línea con el perfil metabólico y la clasificación metabólica propuesta en este trabajo. La línea más glicolítica (MCF7) tuvo un valores de pH intracelular de 8.6, en contraste con las líneas dependientes del metabolismo mitocondrial (MDA-MB-231 y MDA-MB-468), mostraron unos valores de pH intramitocondrial de 9.2-9.3. Curiosamente, la línea celular SKBR3 presenta un perfil metabólico intermedio, con propiedades entre los dos perfiles anteriores.
