Interacciones de Oligomanósidos con el Anticuerpo 2G12 (Anti VIH-1). Estudios por RMN y Modelización Molecular.
- Autores: Pedro Miguel Enríquez-Navas
- Directores de la Tesis: Jesús Angulo Álvarez (dir. tes.), Soledad Penadés Ullate (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2011
- Idioma: español
- ISBN: 9788469478349
- Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Ángel de la Rosa Acosta (presid.), Concepcion Gonzalez Bello (secret.), Pedro Manuel Nieto Mesa (voc.), Margarida Gairí Tahull (voc.), Jesús Jiménez Barbero (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
La presente Tesis Doctoral titulada Interacciones de oligomanósidos con el anticuerpo 2G12 (antiVIH-1). Estudios por RMN y modelización molecular, estudia las interacciones entre el anticuerpo 2G12 y ciertos oligomanósidos (lineales y ramificados) que son motivos estructurales de un glicano (tipo high-mannose) presente en la cubierta del virus del SIDA. La interacción entre este glicano y el anticuerpo 2G12 ha sido previamente determinada y estudiada por diferentes técnicas, pero nunca por RMN.
Esta Tesis se fundamenta en la nueva filosofía de trabajo para el diseño racional de vacunas conocida como retrovaccinología, la cual trata de desarrollar el mejor antígeno para un anticuerpo previamente definido. Así, el caso particular de esta Tesis se basa en el descubrimiento y aislamiento de anticuerpos que son capaces de neutralizar el VIH (como lo es el anticuerpo 2G12) de pacientes infectados por el virus pero que no desarrollan la enfermedad del SIDA.
Se han caracterizado estructuralmente las interacciones de 9 oligomanósidos, modelos de las distintas regiones potencialmente antigénicas del glicano high-mannose, con el anticuerpo monoclonal humano 2G12 (anti-VIH-1), en disolución, mediante técnicas espectroscópicas de RMN de observación de ligando (STD NMR y NOE transferido).
Se han determinado experimentalmente los epítopos de los oligomanósidos para la interacción con el anticuerpo 2G12, a resolución atómica. Se han cuantificado teóricamente los datos en disolución, comparándolos, en los casos en los que fue posible, con algunas estructuras existentes en la literatura provenientes de cristalografía de rayos X. La cuantificación se ha realizado mediante cálculos de matriz de relajación completa e intercambio conformacional, implementados en el programa CORCEMA-ST. Todos los datos sugieren que los oligomanósidos, como ligandos monovalentes, interaccionan exclusivamente con los sitios primarios de reconocimiento del anticuerpo. Los oligomanósidos lineales son reconocidos por el extremo no reductor de la cadena oligosacarídica, verificando la importancia del resto disacarídico Man¿1,2Man en dicho extremo. Los ligandos ramificados interaccionan de forma diferente: el pentasacárido (formalmente una repetición del disacárido Man¿1,2Man) interacciona mediante dos modos de asociación que se alternan en el sitio de reconocimiento primario, involucrando cada una de las dos ramas, con afinidades en el mismo orden de magnitud; por el contrario, el heptasacárido, no natural (formalmente una repetición del trisacárido Man¿1,2Man¿1,2Man), interacciona de forma preferente mediante la rama natural (tipo D1).
Se ha verificado que el anticuerpo 2G12 es capaz de reconocer la ramificación D2 del glicano high-mannose, mediante estudios de STD NMR de las interacciones de dos ligandos miméticos de cada una de las ramas (D2 y D3) constituyentes del pentasacárido. Estos datos han confirmado experimentalmente la validez de la interpretación de los datos de RMN de la interacción del pentamanósido, en términos de una asociación dual. Este modo de interacción no se había detectado en los estudios de cristalografía de rayos X descritos en la literatura.
Se ha llevado a cabo un estudio minucioso de los factores experimentales que tienen una influencia marcada en las determinaciones experimentales de constantes de disociación ligando-proteína mediante titulaciones de un solo ligando detectadas por espectroscopía STD NMR. Se ha demostrado la elevada influencia en el resultado final que tienen los parámetros: tiempo de saturación, intensidad STD, y fracción de ligando enlazado.
Se han caracterizado los fenómenos físico-químicos que son responsables en las desviaciones de las medidas de constantes de disociación por STD NMR. En condiciones de fracciones de ligando enlazado elevadas, la reasociación del ligando tiene lugar en una escala de tiempos muy inferior a los tiempos característicos de relajación (selectivos) de los protones del ligando en el estado libre, y se produce una subestimación de los factores STD-AF que lleva a una sobreestimación final de la constante de disociación determinada.
Se ha desarrollado un protocolo experimental: Isoterma de asociación de pendientes iniciales de crecimiento de los factores STD, que se ha demostrado capaz de cancelar los efectos de los factores anteriormente identificados. Mediante dicho protocolo las medidas de constantes de disociación por STD NMR son comparables a las de otras técnicas (microcalorimetría de titulación isotérmica, etc.) y no presentan todos los problemas que se han identificado en la presente tesis doctoral, y algunos de los cuales ya habían sido descritos en distintos trabajos a lo largo de la literatura.
Se ha aplicado el nuevo protocolo a las medidas de las constantes de disociación de los oligomanósidos y el anticuerpo 2G12. El mínimo elemento estructural constituyente del glicano high-mannose que confiere mayor afinidad por el anticuerpo 2G12 es el trimanósido Man¿1,2Man¿1,2Man. El tetramanósido tipo D1 presenta la misma afinidad, y el dimanósido Man¿1,2Man presenta una afinidad considerablemente inferior. Los ligandos ramificados presentan diferentes afinidades: el pentamanósido una afinidad similar al dimanósido básico Man¿1,2Man, y el heptamanósido mayor afinidad que éste, pero inferior a las de tri- y tetramanósido D1.
Se ha verificado la preferencia de reconocimiento molecular de la ramificación D1 del heptamanósido no natural por el anticuerpo 2G12, a pesar de que ambas ramas contienen el elemento estructural trimanósido identificado como requerimiento mínimo para la afinidad por el anticuerpo. Un estudio mediante STD NMR para el ligando independiente mimético de la ramificación no natural ha demostrado una caída de cinco veces en la afinidad, respecto a la ramificación D1 natural.
Se ha estudiado el efecto de la disposición espacial multivalente de los ligandos oligomanósidos sobre las afinidades respectivas por el anticuerpo 2G12. A tal efecto se han utilizado nanopartículas de oro funcionalizadas con los distintos oligomanósidos (gliconanopartículas), y sus afinidades se han determinado mediante titulaciones competitivas con los correspondientes oligomanósidos monovalentes. En el caso del tetramanósido D1 (Man¿1,2Man¿1,2Man¿1,3Man), se ha demostrado el beneficio termodinámico de la disposición multivalente del oligomanósido, incrementando la afinidad hasta dos órdenes de magnitud.
