Resumen de Nuevas estrategias para la criopreservación de esperma ovino mediante el uso de antioxidantes, gradientes y vitrificación
1. Introducción o motivación de la tesis La inseminación artificial (IA) es una herramienta esencial dentro de los programas de mejora genética, ya que permite la conexión genética entre rebaños, apoya el control genealógico y acelera el progreso genético y la difusión de la mejora. Sin embargo, en el ganado ovino su aplicación de forma rutinaria no está tan extendida como puede ser en el porcino o vacuno, debido a la gran variabilidad de resultados de fertilidad obtenidos, la baja rentabilidad de las explotaciones y la rápida pérdida de calidad seminal durante su almacenamiento como en otras especies.
Los factores que determinan el éxito de la IA en el ganado ovino son varios, tales como la compleja anatomía del cervix, el manejo del rebaño, el sistema de explotación, la sanidad, el estado fisiológico de las ovejas, los factores ambientales, el factor humano, además de la técnica de deposición del semen, la composición de los diluyentes empleados o la técnica de preservación del semen utilizada entre otros. A esto hay que añadirle que los espermatozoides de carnero son células que son particularmente sensibles al choque por frío, a las variaciones osmóticas y a la toxicidad generada por los solutos empleados durante los diferentes procesos de preservación del semen. Esta sensibilidad extrema es atribuida al bajo ratio entre colesterol: fosfolípidos y a la alta proporción de ácidos grasos poliinsaturados, los cuales requieren la implementación de diversas estrategias con el fin de mejorar la calidad y viabilidad espermática. En este contexto y atendiendo a algunos de los factores más determinantes que condicionan el éxito de la IA, se ideó el trabajo de la presente tesis doctoral, aplicando nuevas estrategias para mejorar la criopreservación de esperma ovino mediante el uso de antioxidantes, gradientes y vitrificación.
2. Contenido de la investigación El primer estudio tuvo como objetivo analizar las características de los espermatozoides de carnero sometidos a diferentes concentraciones de sacarosa y la influencia de la temperatura de almacenamiento (22°C o 5°C) previa a la vitrificación. Los eyaculados se diluyeron en TCFEY (Tris-ácido cítrico-fructosa y 20% de yema de huevo), y se prepararon dos alícuotas a una concentración final de 100 × 106 espermatozoides/ml, una mantenida a temperatura ambiente (22°C) y la otra a 5°C. En el primer experimento, se analizó la toxicidad de los diluyentes compuestos por sacarosa en los espermatozoides, y para ello las muestras de esperma a diferentes temperaturas se diluyeron (1:2) en TCF-BSA 2% (control) o en el mismo diluyente complementado con varias concentraciones de sacarosa (0.4 M, 0.6 M y 0.8 M). En el segundo experimento se estudiaron los efectos de la vitrificación, donde las muestras de semen se mezclaron con diferentes concentraciones de crioprotectores (sacarosa) y fueron vitrificadas sumergiéndolas directamente en nitrógeno líquido. En ambos experimentos, se evaluaron los parámetros de motilidad, morfología, funcionalidad de la membrana (HOST), viabilidad, integridad del acrosoma y la fragmentación del ADN espermático. La prueba de toxicidad mostró diferencias significativas (p ≤ 0.05) cuando se utilizaron diferentes concentraciones de sacarosa; observándose una menor motilidad (total y progresiva), % de espermatozoides con morfología normal y funcionalidad de la membrana cuando la concentración de sacarosa fue mayor, con respecto al tratamiento control. Las muestras mantenidas a temperatura ambiente mostraron una viabilidad significativamente mayor (p ≤ 0.05) que las muestras almacenadas a 5°C. En cambio, aunque la calidad del esperma vitrificado se redujo drásticamente en comparación con el semen fresco, la sacarosa se asoció con una mayor motilidad total, viabilidad y funcionalidad de la membrana. Esta mejora estuvo estrechamente ligada a la temperatura a la que se había mantenido previamente el esperma, mostrando valores más altos cuando el esperma se almacenó a 5°C.
En aras de determinar los daños sufridos por los espermatozoides durante la vitrificación, en el segundo experimento se procedió a analizar las variaciones ultraestructurales de estas células cuando eran sometidas a diferentes protocolos de criopreservación, utilizando para ello técnicas de imagen de alta resolución, con el fin de observar las estructuras espermáticas dañadas durante estos procesos. Los eyaculados fueron agrupados (pool) y diluidos con un diluyente con base de Tris. Se prepararon alícuotas que contenían 300 × 106 espermatozoides /ml que fueron evaluadas a) tras la recolección de semen (pool), b) tras la congelación convencional, c) tras la vitrificación de muestras mantenidas a temperatura ambiente (22°C) previo a la vitrificación, y d) tras la vitrificación de muestras mantenidas a 5°C previo a la vitrificación. Se evaluaron los parámetros de motilidad, integridad del acrosoma, fragmentación del ADN y morfología. Los cambios subcelulares de los espermatozoides fueron evaluados y descritos mediante microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido (MEB) y microscopía electrónica de transmisión (MET). El mantenimiento de espermatozoides a 5 °C previo a la vitrificación y el uso de la sacarosa a 0.4 M mostraron menores dimensiones para el área, la longitud y el ancho de la cabeza de los espermatozoides en comparación con el semen fresco, el congelado y el semen mantenido a 22°C previo a la vitrificación.
Se observó que la anchura y la longitud de la cabeza son significativamente mayores (P < 0.0001) en espermatozoides frescos que en las muestras de esperma vitrificadas. Por ello, se hipotetiza que una mayor pérdida de líquido intracelular durante la vitrificación podría prevenir daños en el espermatozoide a raíz de la reducción de la formación de cristales de hielo, aunque quizás estos efectos protectores pudieran deberse más a la reducción de cristales extracelulares como consecuencia de la modificación de las propiedades físicas tras la adición de altas concentraciones de azucares. Este es el primer estudio ultramicroscópico realizado en espermatozoides ovinos vitrificados que confirma las alteraciones funcionales del esperma detectadas previamente.
Durante los procesos de criopreservación del semen, la proliferación de especies reactivas de oxigeno (EROs) produce un desequilibrio celular que deriva en daños irreversibles. Por ello, en el tercer y cuarto experimento se planteó el uso de antioxidantes, teniendo en cuenta sus efectos positivos frente a las EROs descritos por numerosos investigadores. Para ello, el objetivo del tercer estudio fue evaluar el efecto de la adición de diferentes concentraciones de dos antioxidantes derivados del aceite de oliva, el hidroxitirosol (3, 4-dihidroxifenilethanol, HT) y el 3, 4-dihidroxifenilglicol (DHPG) sobre el semen de ovino durante el proceso de congelación-descongelación. Los espermatozoides se recolectaron, agruparon (pool) y diluyeron con un diluyente comercial, dividiendo en alícuotas complementadas con diferentes concentraciones (10 μg/ml, 30 μg/ml, 50 μg/ml y 70 μg/ml) de HT, DHPG y una mezcla (MIX) de ambos antioxidantes. También se preparó un grupo de control, sin antioxidantes. Se evaluó la motilidad, viabilidad, integridad del acrosoma, potencial de la membrana mitocondrial y la peroxidación lipídica (PL).
Los espermatozoides de carnero congelados exhibieron valores más bajos para la motilidad, integridad de la membrana, integridad del acrosoma y el potencial de la membrana mitocondrial que las muestras de semen fresco (P ≤ 0.01). Sin embargo, cuando se añadieron los antioxidantes, los espermatozoides descongelados mostraron una menor LPO, registrando valores similares a los espermatozoides frescos. Por el contrario, el grupo control sin antioxidantes mostró una LPO significativamente mayor (P ≤ 0.01) tras la descongelación. La adición de la mezcla entre HT + DHPG (MIX) tuvo un impacto negativo en la integridad de la membrana de los espermatozoides y la integridad del acrosoma, sugiriendo que la suplementación de un antioxidante puro tiene potencial para ofrecer resultados superiores. En conclusión, el HT y el DHPG exhibieron un efecto positivo sobre los espermatozoides descongelados en la medida en que redujeron la LPO. Estos antioxidantes derivados del aceite de oliva tienen el potencial de mejorar la calidad del esperma congelado, aunque deben de realizarse estudios adicionales para analizar el efecto del antioxidante a diferentes tiempos tras la descongelación.
En el cuarto estudio se evaluó el efecto de la adición de HT, DHPG y MIX sobre el semen ovino durante su almacenamiento a 5ºC y 15ºC. Los espermatozoides se recolectaron, se agruparon (pool) y se diluyeron para luego dividirlos en alícuotas suplementadas con diferentes concentraciones (5 μg / ml, 10 μg / ml, 50μg / ml y 100 μg / ml) de HT, DHPG y una mezcla (MIX) de ambos antioxidantes. Se evaluó la motilidad del esperma a 0, 6, 24, 48, 72, 96 h tras la dilución del semen y también la fertilidad. Los resultados mostraron que la adición de antioxidantes no mejoró significativamente la motilidad total y progresiva para ambas temperaturas. Sin embargo, en las muestras almacenadas a 5 ºC, los valores de LIN (48, 72, 96 h), STR (0h) y WOB (0, 48, 72, 96h) disminuyeron significativamente en comparación con el tratamiento control cuando se agregó una alta concentración de antioxidante (MIX100 o HT100). Por el contrario, a 15ºC, MIX50 mostró valores de VCL significativamente más altos a las 6 h que el tratamiento control, al contrario que MIX100 a las 96 h, que disminuyó significativamente los valores de VCL. En cuento al ensayo de inseminación artificial, no se observaron diferencias significativas cuando se agregaron antioxidantes en el diluyente del semen. En conclusión, el uso de HT, DHPG y la combinación de ambos antioxidantes mostraron un pequeño impacto en la motilidad del esperma. Por esta razón, es necesario desarrollar estudios adicionales donde se estudiarán diferentes parámetros de semen.
Los resultados de la adición de antioxidantes podrían estar influenciados por otros factores como el papel desempeñado por los machos, los tipos de diluyente utilizado y la concentración y el tipo de antioxidante utilizado. En los que respeta a los diluyentes, los más utilizados contienen yema de huevo o leche desnatada. Sin embargo, son productos de origen animal y presentan un riesgo sanitario potencial, ya que pueden ser vectores para la transmisión de enfermedades, y derivar en contaminación microbiana lo que podría favorecer la producción de endotoxinas. En los últimos años para la preservación del semen se han utilizado otras sustancias de origen no animal, como las lecitinas derivadas de las plantas, para evitar este tipo de problemas, siendo la lecitina de soja una de las más utilizadas.
Por ello, el quinto estudio se centró en evaluar el efecto de diferentes diluyentes sobre la motilidad espermática y la fertilidad durante el almacenamiento de semen de carnero a 5 ºC y 15 ºC utilizando para ello diluyentes de origen animal y vegetal. El semen se recolectó, se agrupó (pool) y se diluyó en tres diluyentes comerciales: Inra 96® (INRA) con base de leche desnatada; la fracción A del Biladyl® (BIL) con yema de huevo; y Ovixcell® (OVIX) a base de lecitina de soja. Se evaluó la motilidad espermática a las 0, 6, 24, 48, 72 y 96 horas. Para evaluar la fertilidad, se utilizaron muestras almacenadas a 15ºC tras la dilución de estas en INRA y OVIX. Los resultados mostraron que la motilidad progresiva fue significativamente mayor hasta las 72 h de almacenamiento en muestras de esperma mantenidas a 5ºC en comparación con 15ºC, similares para cada uno de los diluyentes probados. Cuando las muestras se almacenaron a 5ºC en OVIX, los parámetros cinemáticos como la velocidad (excepto VCL), la trayectoria (LIN, STR, WOB), ALH y BCF fueron mayores que para INRA y BIL. No se detectaron diferencias significativas en la tasa de preñez entre el INRA (62.6%) y OVIX (58.9%). En conclusión, el almacenamiento de semen a 5ºC con el diluyente OVIX es una opción interesante, ya que no se utilizan componentes de origen animal y ofrece una eficacia in vitro e in vivo similar a la de otros diluyentes que contienen componentes de origen animal.
El sexto estudio se planteó con el fin de aislar la mejor fracción de un eyaculado para garantizar la selección de la mejor población de espermatozoides que permita lograr mejores resultados tras la IA. Para este propósito, tres fracciones de esperma fueron separadas con la ayuda de la centrifugación coloidal de una sola capa (SLC). Se evaluaron la tasa de recogida espermática, la calidad y las subpoblaciones de cada fracción obtenida. Se utilizó semen de moruecos con buena calidad seminal, dividido en dos altas concentraciones espermáticas (800 y 3 mil millones esperma/ml; C800 y C3000, respectivamente) que fueron procesados por SLC. En el grupo C3000, la tasa de recogida de esperma en la fracción 1 fue significativamente mayor (p ≤ 0,05) que en la fracción 3. Se observó que la fracción 1 en C3000 contenía un porcentaje significativamente mayor (p ≤ 0,05) de espermatozoides (53,2%) que C800, mientras que la tasa de recogida de espermatozoides en la fracción 2 fue menor (25,2% vs 45,4%). Esto sugiere que la SLC no permite la separación adecuada de las poblaciones de espermatozoides. En base a la motilidad espermática, se identificaron tres subpoblaciones diferentes: SP1, rápidos y progresivos (36%); SP2, baja velocidad y sin progresividad (20,1%); y SP3, espermatozoides rápidos y no lineales, con movimiento flagelar activo (43,9%). Los resultados sugieren que la SLC no permite la separación adecuada de las poblaciones de espermatozoides cuando se utiliza en las muestras de semen de morueco de buena calidad y que contienen altas concentraciones de espermatozoides.
3. Conclusión DEL CAPÍTULO 1: STORAGE TEMPERATURE AND SUCROSE CONCENTRATIONS AFFECT RAM SPERM QUALITY AFTER VITRIFICATION Arando A., González A., Delgado J.V., Arrebola F.A., Perez-Marín C.C. Anim. Reprod. Sci. 181, 175-185 (2017).
I. La baja calidad espermática observada en semen vitrificado de carnero desaconsejan su uso mediante inseminación artificial, aunque el empleo de otras tecnologías como la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) podrían ayudar a superar dicho hándicap.
II. La refrigeración de los espermatozoides a 5ºC previa a la vitrificación ofrece una mejora de los resultados de calidad espermática.
III. El uso de la sacarosa como agente crioprotector no permeable permite preservar eficazmente la morfología de los espermatozoides y la integridad del ADN espermático durante su vitrificación.
DEL CAPÍTULO 2: VITRIFICATION INDUCES CRITICAL SUBCELLULAR DAMAGES IN RAM SPERMATOZOA. Arando A., Delgado J.V., Arrebola F.A., León J.M., Alcalá C.J., Pérez-Marín, C.C. Cryobiology 87, 52-59 (2019).
IV. El tamaño de las células espermáticas se reduce significativamente tras la vitrificación en comparación con las muestras de semen fresco y congelado, sugiriendo que dicha diferencia es consecuencia del tipo de crioprotectores y método de criopreservación utilizados.
V. Los defectos en las mitocondrias detectados por microscopía electrónica de transmisión en espermatozoides vitrificados pueden explicar la reducida motilidad espermática observada.
VI. La integridad del acrosoma se redujo significativamente tras la vitrificación. Estos hallazgos fueron evidentes con el uso de la microscopía electrónica de transmisión, observando la ausencia de contenido acrosómico y daños en la membrana acrosomal.
VII. La evaluación de la ultraestructura espermática demuestra el impacto altamente negativo de la vitrificación sobre los espermatozoides y destaca la necesidad de estudios adicionales para implementar el uso de nuevos agentes crioprotectores que protejan de manera eficiente la membrana plasmática, el acrosoma y las mitocondrias durante la vitrificación.
VIII. La información ultraestructural obtenida tras los diferentes procesos de criopreservación proporciona un enfoque más integral para la conservación de espermatozoides y un conocimiento más profundo sobre las estructuras dañadas en los espermatozoides durante estos procesos.
DEL CAPÍTULO 3: EFFECT OF DIFFERENT OLIVE OIL-DERIVED ANTIOXIDANTS (HYDROXYTYROSOL AND 3,4-DIHYDROXYPHENYLGLYCOL) ON THE QUALITY OF FROZEN-THAWED RAM SPERM. Arando A., Delgado J.V., Bermúdez-Oria A., León J.M., Fernández-Prior A., Nogales S., Pérez-Marín C.C. Cryobiology 86, 33-39 (2019).
IX. La suplementación con antioxidantes derivados del aceite de oliva tales como el HT, DHPG o la combinación de ambos en diluyentes con base Tris ofrecen una protección significativamente superior frente a la peroxidación de la membrana plasmática en muestras de semen criopreservado con respecto al control, con valores similares a los obtenidos en el semen fresco.
X. La motilidad espermática (incluyendo diversos parámetros cinemáticos y de velocidad), la integridad de membrana, la integridad del acrosoma y el potencial mitocondrial no se vieron afectados positivamente tras la adición de los antioxidantes estudiados.
XI. El uso de diluyentes que contenían una combinación de HT y DHPG indujo una reducción en la viabilidad espermática e integridad del acrosoma en comparación con aquellos diluyentes que contenían solo un tipo de antioxidante, recomendándosela adición de un solo tipo de antioxidante, evitando su combinación para congelación espermática.
DEL CAPÍTULO 4: EFFECT OF OLIVE-DERIVED ANTIOXIDANTS (3,4-DIHYDROXYPHENYLETHANOL AND 3,4-DIHYDROXYPHENYLGLYCOL) ON SPERM MOTILITY AND FERTILITY IN LIQUID RAM SPERM STORED AT 15ºC OR 5ºC. Arando A., Delgado J.V., Bermúdez-Oria A., León J.M., Fernández-Prior A., Nogales S., Pérez-Marín C.C. (EN PREPRACIÓN).
XII. El uso de HT, DHPG y la combinación de ambos antioxidantes durante la refrigeración de semen ovino no mostró un efecto significativo en la motilidad total y progresiva, ofreciendo una pequeña mejora en los parámetros cinemáticos de los espermatozoides.
XIII. El uso de HT, DHPG y la combinación de ambos antioxidantes no mostró un efecto significativo sobre la fertilidad.
DEL CAPÍTULO 5: EFFECT OF THREE COMMERCIAL EXTENDERS ON SPERM MOTILITY AND FERTILITY IN LIQUID RAM SPERM STORED AT 15ºC OR 5ºC.Arando A., Delgado J.V., León J.M., Nogales S., Navas-González F.J., Pizarro M.G., Pérez-Marín C.C. Acta Veterinaria Hungarica, 67, 2 (2019).
XIV. El diluyente con proteínas de origen vegetal (Ovixcell) empleado para la refrigeración de esperma ovino mostró resultados similares tanto in vitro como in vivo en comparación con otros de origen animal (Inra 96 y Biladyl), lo que demuestra su capacidad para reemplazar a dichos diluyentes.
XV. El almacenamiento de dosis seminales a 5ºC ofrece mejores resultados para la conservación del semen durante días en comparación con las muestras almacenadas a 15ºC, las cuales a partir de las 72 horas de almacenamiento comienzan a disminuir la calidad seminal.
DEL CAPÍTULO 6: CAN COLLOIDAL CENTRIFUGATION SEPARATE THE BEST SPERM POPULATION IN NORMOSPERMIC RAM SPERM SAMPLES? Pérez-Marín C.C., Arando A., Marín A., Delgado J.V. (EN PREPARACIÓN).
XVI. La centrifugación coloidal de una sola capa no es un método eficaz para la selección de espermatozoides cuando se procesan muestras que contienen una alta concentración de espermatozoides con buena calidad.
XVII. La separación de subpoblaciones mediante centrifugación coloidal de una sola capa no es efectiva en muestras de semen ovino fresco normospérmico.
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