Chem-mdbp: development of chemistry-based multiplexing diagnostic beadplatforms
- Autores: Antonio Delgado González
- Directores de la Tesis: Rosario María Sánchez Martín (dir. tes.), Juan Jose Diaz Mochon (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2019
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: María de la Fuente Freire (presid.), Alicia Dominguez Martin (secret.), Marco Ragusa (voc.), Ana Conejo García (voc.), Mark Nitz (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Granada
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
- español
La biotecnología y la nanotecnología se encuentran en su máximo esplendor a tenor de las excelentes publicaciones científicas que atesoran, las importantes inversions de capital y los desarrollos tecnológicos derivados que están constantement revolucionando la ciencia y la sociedad. El desarrollo y la utilización de los llamados materiales “smart” así como los nanomateriales, han supuesto un antes y un después en la ciencia. Las tecnologías novedosas surgidas en consencia generan un impacto incalculable tanto a nivel económico como en el conocimiento. En este contexto, esta tesis doctoral tiene como objetico el utilizar estos materiales “smart” y las tecnologías recientes para crear una plataforma enfocada en el diagnóstico y basada en partículas. Esta plataforma permite realizar tanto ensayos moleculares como ensayos celulares mediante la aplicación de la química. Para ello, se ha desarrollado una plataforma basada en partículas de poliestireno que combina ácidos nucleicos, metales y diferentes plataformas analíticas.
En cuanto a los ensayos moleculares, la plataforma de detección combina partículas magnéticas de poliestireno y la tecnología Chem-NAT, que es una tecnología libre de PCR y basada en química para la detección de ácidos nucléicos con resolución de una única base. Para ello se emplean ácidos nucleicos peptídicos con una posición libre de base (DGL) y cuyas secuencias son totalmente complementarias a las sequencias de los ácidos nucleicos de interés. Esto se debe a que los ácidos nucleicos actúan como un molde de una reacción de incorporación dinámica específica, y controllada termodinámicante, de una nucleobase modificada con un grupo aldehído (Smart-NB) en la posición donde no hay nucleobase. En esta reacción se produce a través de la formación de un enlace covalente reversible, una iminio, que es posteriormente reducido a un enlace covalente irreversible, formando una amina terciaria. Debido al control termodinámico ejercido por el ácido nucleico de interés, esta tecnología es altamente selectiva y específica, evitando la presencia de fasos positivos.
Esta tecnología Chem-NAT ha sido usada tanto para aplicaciones cuantitativas como cualitativas: (i) Aplicaciones cuantitativas: Se presenta la síntesis y optimización de sondas DGL para la detección directa y cuantificación de miR-21 mdiante el uso plataformas basadas en fluorescencia, y a través de conjugación por química dinámica (DCL). La optimización de las sondas DGL se ha llevado a cabo por citometría de flujo, mientras que para la detección directa y cuantificación se ha utilizado un lector de placas basado en fluorescencia. MiR-21 has sido detectado y cuantificado con éxito a partir de células tumorales y de plasma de pacientes con cáncer de pulmón (NSCLC) en estadíos avanzados. Además, también se ha evaluado la capacidad de la plataforma diagnóstica para realizar ensayos de “multiplexing” mediante la detección específica de miR-21 y miR-122 en la misma muestra.
(ii) Aplicaciones cualitativas: Se presenta la capacidad dela plataforma diagnóstica para detectar mutaciones de una única base en KRAS. La secuencia KRAS silvestre y la secuencia mutrada G13C KRAS han sido identificadas con éxito en la misma muestra mediante citometría de flujo.
Por otro lado, la plataforma de diagnóstico basada en partículas para ensayos celulares también ha sido presentada en esta tesis doctoral. Nanopartículas reticuladas y amino-functionalizadas de poliestireno fueron conjugadas con fluoróforos y metales, dando lugar a nanopartículas metalofluorescentes para aplicaciones multimodales en diagnóstico. La combinación dual de fluoróforo y metal permitió que las nanopartículas se utilizaran como sondas para técnicas de imagen y citometria, para catalizar reacciones químicas y como reactivos para técnicas basadas en masas. Además, las propiedas intrínsecas de los fluoróforos, como el tiempo de vida meda de fluorescencia, permitó su utilización como sondas para microscopía de tiempo de vida media de fluorescencia. Además, debido a la presencia de metales, especialmente paladio, las nanopartículas metalofluorescentes adquirieron unas interesantes características adicionales sin afectar a la fluorescencia. Por ejemplo, las nanopartículas metalofluorescente con paladio pueden actuar como catalizadores de reacions químicas. Finalmente, debido a su naturaleza dual, las nanopartículas metalofluorescenes pudieron ser empleadas como reactivos en citometría de masas y citometría de flujo.
A través de la combinación de isótopos puros de paladio, las nanopartículas metalofluoresccnetes fueron empleadas como reactivos para codificación celular en citometría de amsas. En esta tesis doctoral, por tanto, se presenta la primera prueba de concepto de codificación celular con dos nanopartículas metalofluorescentes, así como l primer ensayo para codificación de células vivas. En esta prueba de concepto se demuestra la alta capacidad, la inocuidad, la especificidad y la resistencia de las nanopartículas metalofluorescentes para su utilización como reactivos de codificacón de células vivas para citometría de masas y citometría de flujo.
- English
Biotechnology and nanotechnology are two fields in their splendour moments with excellent scientific publications, large and unprecedented investments, and technological developments that are constantly revolutionising science and impacting positively to society. The development and utilisation of smart materials and nanomaterials have meant a before and after in different scientific fields. Novel technologies have emerged as a consequence, generating an invaluable impact both in economic terms and knowledge. In this context, this doctoral thesis aims to take advantage of smart materials and novel technologies to create bead-based platforms, focusing on the diagnosis field, by enabling both cellular and molecular assays, using chemical-based technologies. These bead-based platforms which allow both type of assays, comprise polystyrene particles, novel nucleic acid and metal chemistries and different analytical platforms.
Regarding the molecular assays, the bead-based platform comprises commercially available polystyrene-based magnetic microparticles and Chem-NAT technology, which is a chemical-based PCR-free technology for nucleic acid detection with single base resolution. The Chem-NAT technology employs peptide nucleic acids probes with an abasic position (DGL probes) whose sequences are fully complementary to the target nucleic acids. This is due to the fact that target nucleic acids act as template of a thermodynamically controlled and specific dynamic incorporation of the reactive aldehyde-modified nucleobases (Smart-NB) into the abasic position, through the formation of a reversible covalent bond, an iminium specie, that is thereupon reduced to an stable tertiary amine. Due to the thermodynamic control given by the target nucleic acid this technology is highly selective and specific, avoiding the presence of false positive results.
This Chem-NAT technology was used for both quantitative and qualitative applications: (i) Quantitative application: The synthesis and optimisation of DGL probes for the direct detection and quantification of miR-21 using fluorescence-based readout platforms is presented through dynamic chemistry labelling (DCL). The DGL probes optimisation steps were performed on flow cytometry, whilst the direct detection and quantification was performed on a fluorescence-based microplate reader. MiR-21 was successfully profiled and quantified from tumour cells and from plasma from patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) in advances stages. Moreover, it was assessed the multiplexing capability of the platform by distinguishing miR-21 and miR-122 within the same sample.
(ii) Qualitative approach: The capability of the bead-based platform for testing single nucleotides polymorphisms (SNP) of KRAS is presented. The KRAS WT sequence and the mutated G13C KRAS sequence were successfully identified, within the same sample, by flow cytometry.
On the other hand, the bead-based platforms designed for cellular based assays are presented. Monodispersed cross-linked amino-functionalised polystyrene nanoparticles were functionalised with a fluorophore and a metal, giving rise to metallofluorescent nanoparticles, to achieve multi-modal applications for diagnosis. This dual combination allowed the nanoparticles to be employed for imaging techniques, chemical reactions, and mass-based technologies. They were used as imaging probes for confocal microscopy and/or for flow cytometry. Furthermore, the properties of the fluorophore, like the fluorescence lifetime, allowed their employment as probes in fluorescence life-time imaging. Moreover, the presence of metals, especially palladium, confers additional features without quenching the fluorophore. For instance, palladium nanoparticles can act as catalysts since they are capable of catalysing chemical reactions. Finally, the nanoparticles can be used as mass-tag reagents for mass cytometry along with flow cytometry, what converts them in dual probes.
Through the combination of pure palladium isotopes, the metallofluorescent nanoparticles were employed as mass-tag reagents for mass cytometry barcoding. In the doctoral thesis the first proof of concept (PoC) of the mass-based barcoding with two different metallofluorescent nanoparticles, and the first assays for live cell barcoding using three different metallofluorescent nanoparticles were developed. These two assays demonstrate the high capability, the non-toxicity, the specificity, and resistance of the metallofluorescent nanoparticles to be used as live cell barcodes in mass cytometry and flow cytometry.
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