Optimización del proceso de extracción y amplificación del arn del virus de la hepatitis c en biopsias hepáticas fijadas en paraformaldehido e incluidas en parafina
- Autores: Carolina Soguero Serrano
- Directores de la Tesis: Miguel Bruguera Cortada (dir. tes.), Juan Carlos Saíz Calahorra (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2000
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Mercè Durfort i Coll (presid.), Albert Bosch Navarro (secret.), Elías Campo Güerri (voc.), Antonio Villaverde Corrales (voc.), Miguel Ángel Martínez de la Sierra (voc.)
- Materias:
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- Resumen
La extracción y amplificación del ARN del virus de la hepatitis C, ARN-VHC, proveniente de material de archivo parafinado, presenta serias dificultades permitiendo únicamente amplificar la región conservada 5'NC en biopsias almacenadas hasta 10 años.
OBJETIVOS 1,- Desarrollar un sistema para amplificar el ARN-VHC a partir de biopsias hepáticas incluidas en parafina, que permita hacer estudios retrospectivos de más de 10 años de antigüedad.
2,- Adecuar un sistema de genotipado para este tipo de material.
3,- Optimizar la RT-PCR para poder analizar otras regiones genómicas del VHC distintas a la región 5'NC.
MATERIAL Y MÉTODOS El ARN fue extraído de 50 biopsias hepáticas incluidas en parafina: 23 biopsias de aguja (11 de pacientes con hepatitis crónica NANB diagnosticadas entre 1971-1985-8, con histología hepática normal y 4 biopsias secuenciales de un paciente con recurrencia de la infección por VHC tras el trasplante hepático) y 27 explantes hepáticos entre 1988-1996 (16 por cirrosis asociada al VHC y 11 de otras etiologías).
Los factores que se estudiaron para optimizar la amplificación de la región 5'NC fueron:
A,- rendimiento del fenol en función del pH (4.5, 5.0-5.5, 6.7-7.0).
B,- temperatura y tiempo de digestión con proteinasa K: 60ºC durante 5 horas o bien, 42ºC durante 4 días.
C,- tamaño de la secuencia diana del VHC: 171 pb, 286 pd.
D,- sistema de retrotranscripción: acoplada directamente a la PCR con la AMV o bien en dos viales separados con la MMLV.
Sistemas de genotipado utilizados fueron RFLP y por secuenciación. Las regiones del genoma del VHC diferente a la 5'NC que se intentaron amplificar fueron HVR-1 e ISDR.
RESULTADOS Las condiciones óptimas para amplificar la región 5'NC del VHC para realizar estudios retrospectivos de más de 10 años fueron: fenol pH 4.5, sistema de digestión con proteinasa K a 42ºC durante 4 días con producto de PCR-2 de 171 pb y
