Resumen de Caracterización de interacciones proteína-proteína entre el geminivirus tylcsv y la célula vegetal
El objetivo de este trabajo de Tesis Doctoral ha sido el aislamiento y caracterización de proteínas de la célula vegetal que interaccionen con la proteína de replicación C1, del geminivirus TYLCSV. Para ello se ha utilizado el sistema del doble híbrido en levaduras basado en el factor de transcripción GAL4. Se disponían de dos genotecas de cDNA de plantas (Arabidopsis thaliana y Nicotina bethamiana) fusionadas al dominio de activación de GAL4.
Se clonó el gen C1 de TYLCSV en tres plasmidos cebo distintos, uno de baja expresión (pBD-GAL4) y dos de alta expresión (pAS2 y pGBKT7) pero con características funcionales diferentes. Los resultados obtenidos han sido diferentes dependiendo del plásmido utilizado para expresar la proteína cebo. La estirpe de S.cerevisiae utilizada para realizar las búsquedas (PJ696), posee tres genes chivatos para la interacción entre las dos proteínas de fusión: HIS3, ADE2 y LacZ. Sólo consideramos interacciones positivas, aquellas que eran capaces de activar los tres genes chivatos de la levadura (positivos primarios). Una vez obtenidos lo positivos primarios comprobábamos:
A,- La existencia de la interacción retransformando levaduras con el clon de la genoteca y el plásmido cebo.
B,- Su especificidad, comprobando que el clon no activa por si sólo.
C,- La naturaleza del clon, sucuenciándolo.
En las búsquedas detectamos tres tipos de falsos positivos:
A,- Clones que no se confirmaron cuando se retransformaron levaduras.
B,- Clones que activaban por si solos los genes chivatos.
C,- Clones que recuperaban el fenotipo de interacción, no activaban por si solos, pero cuya secuencia correspondía a un poliA.
La mayoría de los falsos positivos obtenidos fueron de tipo (a) en las búsquedas con el plámido pAS2 y de tipo (b) en las búsquedas realizadas con pGBKT7.
El gen Ubc9 de N.benthamiana (NbUbc9), aislado en este trabajo mediante el sistema del doble híbrido por su i
