Resumen de Transcripción y splicing de brca2 y su relación con la susceptibilidad a cáncer de mama y ovario hereditario
Maria Eugenia Fraile Bethencourt
Introducción: El Cáncer de Mama y Ovario Hereditario (CMOH) es una enfermedad con herencia autosómica dominante caracterizada por la aparición temprana del tumor. Actualmente, aunque se han asociado 26 genes a la aparición de la enfermedad, sólo dos de ellos están considerados como genes principales de cáncer de mama: BRCA1 y BRCA2. El rastreo de los genes BRCA en pacientes de alto riesgo ha dado lugar a la aparición de miles de variantes, muchas de ellas clasificadas como variantes de significado clínico desconocido (VUS). Éstas suelen ser variantes missense, sinónimas, deleciones o inserciones in-frame y variantes en regiones no codificantes como los intrones o las UTRs (Untranslated Region). En este contexto, los ensayos funcionales juegan un papel esencial para conocer el impacto de este tipo de variantes y su asociación con la enfermedad. El objetivo de esta tesis doctoral se centra en el estudio de la transcripción y el splicing de BRCA2. Se pretende estudiar los mecanismos reguladores de la expresión génica y evaluar las variantes que puedan alterar dichos procesos y estar asociadas a la susceptibilidad a CMOH.
Métodos: Las variantes, recogidas de las bases de las principales bases de datos (BIC, UMD, ClinVar y Ensembl) y encontradas en pacientes del sistema de prevención de cáncer de Castilla y León (España), fueron analizadas in silico. Se seleccionaron aquellas variantes que potencialmente alteraban los mecanismos de transcripción o de splicing. El estudio de la transcripción se realizó a través de un vector reportero con el gen de luciferasa bajo el promotor de BRCA2. Los resultados fueron analizados mediante Dual-Luciferase Assays y RT-PCR semi-cuantitativa. Para estudiar el splicing, se construyeron dos minigenes (MGBR2_2-9 y MGBR2_14-20) basados en el vector pSAD (Patente P201231427,CSIC). Las variantes fueron introducidas mediante mutagénesis dirigida y ensayadas en células MCF-7. El estudio de regiones reguladoras se realizó a través de microdeleciones. Los factores implicados en el splicing se estudiaron mediante ensayos de interacción RNA-proteína (pull-down) y ensayos de pérdida de función (siRNA). Los transcritos generados fueron analizados mediante gel de agarosa, secuenciación SANGER y electroforesis capilar.
Resultados: Las secuencias reguladoras de la transcripción se estudiaron a través de 13 microdeleciones a lo largo del promotor de BRCA2. Los resultados mostraron que seis disminuían significativamente la transcripción y tres la aumentaban. Una vez mapeado el promotor, se ensayaron 15 variantes que podrían alterar elementos reguladores, tres de ellas encontradas en pacientes del sistema de prevención de Cáncer de Castilla y León (rs3092989_A, rs206118_G y rs563971900_T). Diez variantes alteraron significativamente la expresión génica, de las cuales, tres provocaron la subexpresión del gen (rs551887850_G, rs570548398_T y rs55880202_T). Cabe destacar que ocho de las 10 variantes reguladoras mapeaban en el cluster 121 de hipersensibilidad a DNAsa, una región crítica para el inicio de la transcripción. Por otro lado, el estudio del splicing reveló que exones 3 a 8, 15, 17 y 18 de BRCA2 requieren de elementos reguladores de splicing (SREs) para su correcto reconocimiento. Además, los resultados indican que los factores SRSF3 y SRSF2 juegan un papel importante en el splicing de los exones 3 y 18, respectivamente. En total, se analizaron mediante minigenes 200 variantes repartidas a lo largo de los exones 2-9 y 14-18 de BRCA2. La mayoría de las variantes produjeron alteraciones en el splicing (104), entre ellas 49 eran exónicas (missense, sinónimas, nonsense y frameshift). Aproximadamente el 70% de las variantes espliceogénicas (73/104) provocaron graves alteraciones (>60% de transcritos aberrantes). En total, 74 variantes fueron clasificadas como patogénicas o probablemente patogénicas según los criterios propuestos por ACMG (American College of Medical Genetic and Genomics), 30 de las cuales se encontraban previamente catalogadas como VUS.
Conclusiones: La transcripción y el splicing son mecanismos fundamentales en la expresión génica que pueden verse alterados debido a cambios en la secuencia de DNA. El promotor de BRCA2 es sensible a cambios de nucleótido y su rastreo debería incluirse en los estudios genéticos de pacientes de CMOH. Por otro lado, cualquier variación en la secuencia podría alterar el splicing. En este contexto, los estudios con minigenes proporcionan datos fiables para evaluar el impacto de las variantes cuando no se dispone de RNA de pacientes.
