New cellular elements associated with DNA: RNA hybrid homeostasis in eukaryotes
- Autores: Marta San Martín Alonso
- Directores de la Tesis: Tatiana Garcia-Muse (dir. tes.), Andrés Aguilera López (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2019
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 198
- Títulos paralelos:
- Nuevos elementos celulares asociados a la homeostasis de híbridos de ADN: ARN en eucariotas
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Jiménez Martínez (presid.), Pablo Huertas Sánchez (secret.), Eulàlia de Nadal Clanchet (voc.), Rodrigo Bermejo Moreno (voc.), Mónica Segurado Carrascal (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
El mantenimiento de la integridad del genoma es esencial para el correcto funcionamiento de las funciones celulares así como la transmisión de la información genética a través de las generaciones. La inestabilidad genética es una patología celular que puede originarse como consecuencia de agentes genotóxicos exógenos que pueden modificar o dañar la estructura del ADN. En otras ocasiones son fallos en los propios procesos endógenos de la célula como la replicación, la transcripción o la reparación de daños en el ADN los pueden dar lugar a cambios y mutaciones en las secuencias del ADN. La inestabilidad genética está asociada a tumorogénesis, envejecimiento y enfermedades genéticas, por lo que el estudio de su origen es esencial en el avance de la biomedicina. Las estructuras llamadas bucles R o R loops surgen co-transcripcionalmente y constan de un híbrido de ADN:ARN y una cadena de ADN simple desplazada. Aunque los R loops tienen importantes funciones fisiológicas, como en la replicación del ADN mitocondrial o en el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas, se ha demostrado que cuando la formación o acumulación de estas estructuras es anómala, puede dar lugar a distintos tipos de inestabilidad en el genoma. Esto se debe a que por un lado pueden suponer un obstáculo para la maquinaria replicativa y por otro lado, la cadena sencilla de ADN está expuesta a sufrir distintos tipos de mutaciones y alteraciones. Es por ello que las células han desarrollado mecanismos para evitar o eliminar los R loops. Uno de estos factores es la proteína Hpr1/THOC1, miembro del complejo THO involucrado en la formación de las ribonucleopartículas (hnRNP). Se ha observado que este factor es clave para impedir la formación de híbridos ADN:ARN durante el proceso de transcripción ya que la hnRNP evita la hibridación del mensajero naciente con la cadena de ADN molde durante la trascripción. Por otro lado, la helicasa Sen1/SETX, actúa en la resolución directa de los híbridos de ADN:ARN, siendo también un elemento importante es el mantenimiento de la estabilidad genómica. En esta tesis nos hemos centrado en estudiar más profundamente los efectos de la eliminación controlada de las proteínas anteriormente mencionadas. Para ello, hemos generado cepas de Saccharomyces cerevisiae con un sistema de degradación inducible, capaces de activar la degradación de Hpr1 o Sen1 de manera controlada y rápida. Esto ha permitido evitar los fenotipos de adaptación anteriormente observados en estirpes mutantes en estos factores e indagar en los mecanismos que dan lugar a la inestabilidad genómica en ausencia de Hpr1 o Sen1. Mediante el uso de estas nuevas herramientas genéticas hemos sido capaces de reproducir fenotipos de inestabilidad ya conocidos, cómo la acumulación de daño en el ADN e hiperrecombinación, así como definir nuevos fenotipos como retraso en la progresión del ciclo celular debido a defectos en replicación. Lo que es mas importante hemos observado diferencias entre las dos cepas en cuanto a la acumulación de R loop a lo largo del ciclo celular. Finalmente hemos identificado y correlacionado a nivel de todo el genoma sitios de acumulación de R loops y marcas de acumulación de daño en el ADN. En el segundo capítulo hemos utilizado una colección de 400 mutantes viables de S. cerevisiae para encontrar nuevos elementos asociados a la homeostasis de los híbridos ADN:ARN. Con este fin, hemos sobre-expresado la proteína Yra1, que provoca un aumento en los fenotipos de inestabilidad asociados a R loop. Yra1 tiene como sustrato el ARNm, pero si se encuentra en exceso en la célula, podría estabilizar los híbridos, dando lugar a la inestabilidad asociada. Mediante el uso de esta herramienta hemos identificado varios candidatos, entre ellos Nsr1, un factor nucleolar con funciones relacionadas con la biogénesis de ribosomas y capaz de interaccionar con el ARN. Hemos observado que la deleción de Nsr1 causa la acumulación de R loops principalmente en el ADN ribosómico, provocando fenotipos de inestabilidad asociados como aumento en las frecuencia de recombinación o problemas de replicación del cromosoma XII. Los resultados obtenidos nos han permitido establecer un modelo por el cual Nsr1 sería capaz de controlar la acumulación aberrante de R loops en el ADN ribosómico y evitar sus efectos deletéreos en la célula. Finalmente, en el último capítulo, nos hemos centrado en el estudio de modificaciones post-traduccionales en la cromatina y su relación con los híbridos de ADN:ARN. Para ello, se decidió extender el estudio de estas modificaciones de histonas a células humanas y C. elegans. Además de explorar más a fondo la fosforilación de la serina 10 de la histona H3 (H3S10ph) y su conexión con los híbridos, hemos descubierto que la modificación H3T3ph, que es la primera fosforilación en la cascada de modificaciones que activan la condensación de la cromatina, también está desregulada en mutantes que acumulan R loops. Esto abre un nuevo frente en la conexión entre R loops y remodelación de la estructura de la cromatina. En conclusión, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral revelan el papel de distintos elementos celulares en el metabolismo de híbridos ADN:ARN y su importancia para controlar la acumulación de estas estructuras en el genoma para preservar su integridad.
