Interacción parásito-hospedador en fasciolosis ovina: mecanismos de respuesta en fases tempranas y tardías
- Autores: Rául Pérez Caballero
- Directores de la Tesis: Álvaro Martínez Moreno (dir. tes.), Leandro Buffoni (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Manuel Molina Caballero (presid.), Isabel Acosta García (secret.), Andres Garcia Campos (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias y Ciencias Agroalimentarias por la Universidad de Córdoba
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
1. Introducción o motivación de la tesis Fasciola hepatica (F. hepatica) es el agente etiológico de la fasciolosis, una enfermedad de afectación hepática que abarca a un amplísimo rango de mamíferos, entre los que se encuentran rumiantes e incluso el ser humano (Mas-Coma y cols., 2005). Es la responsable de las significativas pérdidas de producción estimadas en 3 billones € por año en la comunidad agrícola mundial (Mehmon y cols., 2017), como consecuencia de la interferencia en la producción láctea, la composición de la canal y el incremento del tiempo necesario para alcanzar el peso oportuno para llegar a matadero (Charlier y cols., 2014; Howell y cols., 2015). La OMS ha descrito a la fasciolosis como una zoonosis re-emergente en varias partes del mundo especialmente en África, causada por F. hepatica (zonas templadas) y por F. gigantica (en zonas tropicales) (Mas-Coma, 2005).
En la actualidad la lucha contra la fasciolosis está basada casi exclusivamente en el empleo profiláctico y terapéutico de antihelmínticos. Dentro del espectro farmacológico el triclabendazol (TCBZ) ha demostrado su alta eficacia contra las formas adultas e inmaduras (Barrera y cols., 2012) desde los dos primeros días posteriores a la infección (Boray y cols., 1983), mientras que otros fármacos sólo son eficaces desde la sexta a la decimocuarta semana después de la infección (Kelley y cols., 2016). Como consecuencia, el triclabendazol se ha convertido en el fármaco de elección, particularmente en el tratamiento de la fasciolosis aguda en el ganado ovino. El uso de estas sustancias químicas en el tratamiento de las infecciones parasitarias en animales destinados al consumo humano no se hace sostenible a largo plazo debido a la presencia de los mismos o residuos derivados de ellos en tejidos animales que podrían pasar a la cadena de producción siendo dañinos cuando son consumidos por el hombre. Por ello se hace necesario el uso de programas que monitoricen la existencia de estos compuestos y controlen su exposición al consumidor (Cooper y cols., 2012; Dalton y Mulcahy, 2001). Otras de las desventajas que presenta el uso indiscriminado de fármacos es la pérdida de su eficacia con la consiguiente aparición de resistencias y el principal exponente de este caso es el triclabendazol (Overend y Bowen, 1995; Fairweather, 2009; Kelley y cols., 2016).
Asimismo, el aumento de la resistencia a estos fármacos plantea la necesidad de buscar métodos alternativos de control, como son la selección genética de animales resistentes (Roberts y cols., 1997a, 1997b) y sobre todo métodos de control inmunológico como el desarrollo de vacunas, que se ha mostrado como una alternativa viable y prometedora (Spithill y Dalton, 1998; Dalton y Mucahy, 2001; Dalton y cols., 2003a, 2003b; Meeusen y Piedrafita, 2003; Hillyer, 2005; Mulcahy y Dalton, 1998). Esta última opción es una de las principales aplicaciones que se puede derivar del conocimiento de los mecanismos inmunomoduladores de Fasciola hepatica en sus hospedadores.
El objetivo principal de la presente tesis es estudiar la interacción parásito-hospedador y los mecanismos de respuesta desarrollados en fases tempranas y tardías de la infección por Fasciola hepatica en ovinos vacunados y no vacunados. Este análisis de la respuesta inmunitaria desarrollada en las fases iniciales y tardías se ha efectuado con el estudio de los siguientes objetivos concretos: 1. Analizar la respuesta inmunitaria inducida por la molécula 14-3-3z de Fasciola hepatica, procedentes de formas juveniles, en ensayos vacunales en la especie ovina. Este objetivo se estructura a su vez en los siguientes apartados: 1.1. Determinar la capacidad protectora de la proteína recombinante 14-3-3z en combinación con el adyuvante Montanide ISA 70 VG, considerando como parámetros de protección la alteración de la población parasitaria (carga parasitaria hepática y dinámica de eliminación de huevos) y la reducción del daño hepático (en base al examen anatomopatológico cuantitativo).
1.2. Caracterizar la respuesta inmunitaria adquirida en base a la producción de anticuerpos específicos anti-Fh 14-3-3z de los isotipos IgG1 (respuesta tipo Th2) e IgG2 (respuesta tipo Th1).
2. Investigar la respuesta inmunitaria celular desarrollada en la cavidad peritoneal durante infecciones experimentales, comparando fases tempranas y tardías de la infección. Este objetivo igualmente se concreta en los siguientes apartados: 2.1. Determinar la dinámica de reclutamiento de las células peritoneales implicadas en la respuesta inmunitaria durante la infección, tanto en fases tempranas como tardías.
2.2. Analizar la producción de radicales libres (óxido nítrico y peróxido de hidrógeno) de las células peritoneales durante la fase temprana de la infección en ovinos infectados, no infectados y vacunados con la proteína recombinante catepsina L1.
2. Contenido de la investigación Para la realización del estudio inmunológico, parasitológico y patológico en la especie ovina infectada por F. hepatica se han realizado tres estudios donde se abordan la fases tempranas y tardías de la fasciolosis. Para tal finalidad se emplearon 106 ovejas de raza Merina de 6 meses de edad infectadas con una única dosis de 150 metacercarias de F. hepatica para los siguientes estudios.
En un primer estudio se empleó un antígeno (14-3-3z) de la familia de proteínas 14-3-3, sintetizado por las formas juveniles desenquistadas, con el que poder determinar el perfil inmunológico y el componente parasitológico, haciendo hincapié en el número de fasciolas implantadas en hígado y la dinámica de eliminación de huevos en heces. Se usaron 24 ovejas agrupadas aleatoriamente con el siguiente modelo: el grupo 1 (n=8) fue inmunizado con la proteína recombinante rFh14-3-3z y el adyuvante Montanide, el grupo 2 (n=8) se inmunizó únicamente con Montanide™ ISA 71 VG (control adyuvante) y el grupo 3 (n=8) fue el grupo control de infección (infectado y no vacunado). Ocho semanas posteriores a la primera inmunización los animales fueron infectados oralmente. A las 6 semanas de la infección se realizó un muestreo de heces semanalmente a todos los animales para analizar la dinámica de eliminación de huevos mediante McMaster con sulfato de zinc. La presencia de huevos en heces se detectó a las 8 semanas post-infección en el grupo 1 y las 9 semanas en los grupos 2 y 3. De la misma manera, una vez sacrificados se recogieron los adultos de F. hepatica de los hígados para realizar un recuento, así como su medición y pesaje. El grupo 1 presentó una carga de 52’25 fasciolas, similar al grupo 3 con una carga media de 51’13 y el grupo 2 evidenció una mayor carga parasitaria con 68’13 adultos. La respuesta inmune humoral, para los isotipos IgG1 e IgG2, analizada mediante ELISA indirecto mostró un incremento significativo en IgG1 3 semanas después de la inmunización, mientras que IgG2 aumenta su producción significativamente únicamente después de la inmunización en el grupo 2.
Debido a los ensayos que han demostrado la falta de protección en animales inmunizados con diferentes antígenos de F. hepatica y a la capacidad inmunomoduladora del parásito se hace necesario conocer la respuesta inmune que se desencadena en las primeras fases de la infección. Por ello, el segundo estudio tuvo como objetivo el análisis poblacional de linfocitos (TCD4, TCD8 y WC1+γδ), macrófagos (CD14), células presentadoras de antígenos (MHCII) y células dendríticas (CD83) de cavidad peritoneal de animales infectados y sacrificados en fases iniciales y tardías. En este ensayo se emplearon 37 ovejas de raza merina de seis meses de edad, las cuales fueron divididas aleatoriamente tres grupos atendiendo al momento del sacrificio: el grupo 1 (n=20) (estadios tempranos) y grupo 2 (n=10) (estadios tardíos) fueron los grupos infectados. Los animales del grupo 1 fueron sacrificados a los 1, 3, 9 y 18 días post-infección (dpi), así mismo, el grupo 2 fueron sacrificados a las 14 semanas post-infección (spi). El grupo 3 no se infectó y se describió como grupo control negativo. Los parámetros parasitológicos del grupo 2 mostraron una carga parasitaria de 67’78 adultos con una tasa de implantación con niveles de 45’19%. La presencia de huevos en heces se detectó a las 8 semanas de la infección, alcanzando su máximo a la semana 13. El análisis de las distintas poblaciones leucocitarias se determinó mediante citometría de flujo con distintos anticuerpos monoclonales. Los animales sacrificados en las fases tempranas únicamente mostraron un descenso significativo de los TCD4 a los 1 y 18 dpi. Asimismo, la población de CD14 peritoneal evidenció un descenso a las 9 y 18 dpi, mientras que MHCII y CD83 describen un patrón similar con una significativa disminución a los 3 y 9 dpi. Los animales sacrificados a las 14 semanas aumentaron significativamente su población de WC1+γδ pero sufrieron un descenso significativo en las subpoblaciones de macrófagos y células dendríticas peritoneales.
Continuando con una mejor compresión de los mecanismos defensivos del hospedador frente a esta enfermedad, el tercer trabajo realizado tuvo como objetivo analizar la dinámica poblacional en líquido peritoneal y la producción de radicales libres en animales infectados y vacunados. Para este estudio se emplearon 45 ovejas de raza merina de seis meses de edad agrupadas aleatoriamente como se describe: el grupo 1 (n=5) fueron animales no infectados ni vacunados y fue descrito como grupo control negativo, el grupo 2 (n=20) fue experimentalmente infectado y el grupo 3 (n=20) fue inmunizado con rFhCL1 e infectado. El grupo 1 fue sacrificado a las 12 spi mientras que los grupos 2 y 3 fueron sacrificados a los 1, 3, 9 y 18 dpi. La respuesta inmune humoral evidenció diferencias significativas en IgG1 desde las 6ª semana post-vacunación en el grupo 3 y únicamente a los 1 dpi para IgG2. El número total de leucocitos reveló un aumento significativo a los 9 y 18 dpi para el grupo 2 y 3. Más específicamente, el grupo 2 evidenció un aumento significativo de granulocitos a los 9 dpi y de las tres poblaciones peritoneales a los 18 dpi. Por su parte, el grupo 3 aumentó el número de linfocitos a los 3 y 18 dpi, así como la población de macrófagos y granulocitos a los 9 y 18 dpi. La medición de radicales libres por parte de los leucocitos se determinó mediante citometría de flujo usando 2 reactivos diferentes: DAF-2DA para el óxido nítrico y DCFH-DA para el peróxido de hidrógeno. En relación a la producción H2O2, el grupo 2 incrementó su producción por parte de los macrófagos a los 3 y 9 dpi, y a los 18 dpi por parte de los granulocitos. Asimismo, los granulocitos en el grupo 3 mostraron un aumento de este radical libre a los 9 y 18dpi. Finalmente, la producción de NO en el grupo 2 sufrió un incremento significativo por parte de los granulocitos a los 9 y 18 dpi y en los macrófagos a los 18 dpi. Sin embargo, el grupo 3 aumentó la producción de NO a los 3 dpi por parte de los macrófagos y a los 3, 9 y 18 dpi en los granulocitos.
3. Conclusión La realización de los ensayos descritos ha permitido concluir que el antígeno 14-3-3z presenta un alto poder inmunogénico como se ha demostrado por la significativa producción de anticuerpos anti-rFh14-3-3z IgG1 e IgG2, donde el isotipo IgG1 fue el predominante. La administración de este antígeno no permitió la reducción de la carga parasitaria y el daño hepático en los animales inmunizados.
Se puede concluir que la infección por F. hepatica incrementó el número total de leucocitos en la cavidad abdominal a los 9 y 18 dpi. Con la identificación del inmunofenotipo se concluyó que la subpoblación de WC1+γδ mostró un incremento significativo en los estadios tardíos. La dinámica de CD14 en la cavidad peritoneal muestra una tendencia decreciente durante las fases iniciales y desciende significativamente durante las fases crónicas de la infección. Las células CD83 y MHCII desarrollan una tendencia creciente durante las fases iniciales de la infección para descender significativamente en la fase crónica de la infección.
La producción de los radicales libres (H2O2 y NO) se incrementó en animales vacunados y no vacunados. Los granulocitos fueron el principal grupo celular en la producción de H2O2, mientras que estos primeros junto a los macrófagos predominaron en la producción de NO. Los animales vacunados produjeron una significativa producción de ambos radicales que los infectados.
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