Resumen de Importancia de la desregulación de la degradación de proteínas del ciclo celular en el cáncer
La viabilidad de las células depende del buen funcionamiento de un conjunto de mecanismos moleculares que controlan los procesos biológicos. La ubicuitilación de las proteínas permite degradar rápidamente los componentes reguladores de estos mecanismos, contribuyendo a la precisa sincronización de los complejos procesos celulares. Dada esta crítica función, la desregulación de la degradación de las proteínas está implicada en la transformación tumoral, entre otras enfermedades. Las ligasas de ubicuitina son las responsables de reconocer los sustratos que serán poliubicuitilados y degradados. En esta Tesis nos hemos centrado en el estudio de nuevos sustratos y funciones de dos proteínas F-box del SCF fundamentales en el control del ciclo celular: FBXW7 y βTrCP. En concreto, se presentan los resultados obtenidos del análisis de la degradación dependiente de estas proteínas F-box de tres importantes reguladores de la proliferación celular, PLK1, CDK1 y p53. Se analizan las consecuencias sobre el ciclo celular, y se discute su posible influencia en la formación de tumores o su utilidad como marcadores predictivos o dianas para tratamientos terapéuticos. PLK1 es una quinasa de serina/treonina implicada en diversas etapas del ciclo celular, con importantes funciones en la regulación de la mitosis y la replicación del ADN. En resultados previos de nuestro grupo de investigación determinamos que la proteína PLK1 nuclear es ubicuitilada por SCF(FBXW7) y degradada por el proteasoma en respuesta a los daños en el ADN, lo que impide la formación de los complejos de pre-replicación y, por tanto, la proliferación celular. Durante el transcurso de ese estudio, descubrimos que la ligasa SCF(βTrCP) también ubicuitila a PLK1, por lo que nos dispusimos a estudiar esta potencial degradación de PLK1 y cómo afectaba al ciclo celular. Partimos de la observación de que el tratamiento de las células con geldanamicina, que inactiva específicamente la función chaperona de la proteína de choque térmico HSP90, afecta a la estabilidad de PLK1. En concreto, el tratamiento de las células con geldanamicina potencia la degradación de PLK1 por el proteasoma. Sin embargo, comprobamos que en esta degradación no están implicadas ni APC/C ni SCF(FBXW7), las únicas ligasas de ubiquitina de PLK1 descritas hasta el momento. Estudiamos, pues, si SCF(βTrCP) podía ser responsable de la degradación de PLK1 en esas condiciones. Así, constatamos que βTrCP y PLK1 forman un complejo in vivo mediante interacción directa y que βTrCP induce la poliubicuitilación de PLK1 y su degradación a través del proteasoma. Además, ensayos de silenciamiento y de sobreexpresión, y estudios de subfraccionamiento y de sincronización celular indicaron que SCF(βTrCP) ubicuitila a la fracción citoplasmática de PLK1, esencialmente en las fases G1 y S del ciclo celular. Identificamos a CDK1, que también es sustrato de HSP90, como la principal quinasa implicada en este proceso. PLK1 solo puede degradarse debido al tratamiento con geldanamicina a corto plazo, ya que posteriormente CDK1 es también degradada y, por tanto, PLK1 se acumula. Se trata, pues, de una degradación transitoria y estrictamente regulada. Finalmente, estudiamos la relevancia fisiológica de esta degradación. Descubrimos que la inhibición de HSP90 retrasa el avance del ciclo celular en la transición G1/S, a través de la degradación de PLK1 mediante SCF(βTrCP)/proteasoma. Este retraso se debe a que, en estas condiciones, CDH1 no se degrada por PLK1 y los sustratos de APC/C(CDH1) necesarios para la transición G1/S no se acumulan. Estos resultados han sido publicados en The FASEB Journal (Giráldez S, Galindo- Moreno M, Limón-Mortés MC, Rivas AC, Herrero-Ruiz J, Mora-Santos M, Sáez C, Japón MÁ, Tortolero M, Romero F. (2017). G1/S phase progression is regulated by PLK1 degradation through the CDK1/βTrCP axis. The FASEB Journal 31: 2925- 2936). CDK1 es otra quinasa esencial en la regulación del ciclo celular. En estudios previos de nuestro grupo se demostró que CDK1 es ubicuitilada por SCF(βTrCP) y degradada por el lisosoma, lo que contribuye a mantener constantes los niveles de la proteína en las diferentes fases del ciclo celular. Además, el daño en el ADN puede inducir la degradación o el incremento de CDK1 dependiendo del tipo celular. En el presente estudio caracterizamos molecularmente la degradación de la proteína utilizando como modelo una línea celular tumoral de cáncer de mama y otra no tumoral derivada de tejido mamario normal humano. En ambas líneas, el tratamiento con diferentes agentes quimioterapéuticos empleados en clínica o con agentes que provocan estrés proteolítico indujo la degradación de CDK1. Esta proteólisis está mediada por la vía de la autofagia selectiva, ya que tanto la inducción de la autofagia como su bloqueo afectan al nivel de la proteína. Así, cuando se estimula la autofagia tratando las células con trehalosa observamos una disminución de CDK1. En los experimentos complementarios, el bloqueo del lisosoma con concanamicina A o bafilomicina A1 produjo el incremento de los niveles de la quinasa. El bloqueo del proteasoma a corto plazo también induce la degradación de CDK1 por la ruta de la autofagia. Sin embargo, cuando se bloquea el proteasoma a tiempos más largos, CDK1 se insolubliza formando parte de una estructura denominada agresoma, previamente a su degradación por el lisosoma. Para conocer el mecanismo molecular implicado en la degradación de CDK1 por autofagia, se disminuyó la cantidad de proteínas LC3 o p62, dos proteínas esenciales para esta ruta de degradación, mediante ensayos de silenciamiento. Tanto la disminución de p62 como la de LC3 produjeron un incremento de CDK1. Esto sugería una interacción de CDK1 con la maquinaria de la autofagia, que se confirmó al realizar ensayos de coinmunoprecipitación de CDK1 con ambas proteínas en células tratadas con inhibidores de las enzimas lisosomales. Se comprobó que efectivamente CDK1, p62 y LC3 forman un complejo in vivo. Asimismo, detectamos una interacción entre CDK1 y HDAC6, otra proteína de la maquinaria de la autofagia que, entre otras cosas, permite la acumulación de proteínas poliubicuitiladas en los agresomas para su posterior degradación por el lisosoma. Estas interacciones, además, son dependiente de βTrCP, ya que el mutante de CDK1 en su fosfodegrón pierde la capacidad de unirse a p62, LC3 y HDAC6. Finalmente, ensayos de subfraccionamiento mostraron que tanto CDK1 como p62 y HDAC6 se encuentran en gran medida en la fracción insoluble cuando se tratan las células con un inhibidor del proteasoma a largo plazo. Se corroboró la co-localización de estas tres proteínas en los agresomas, en estas condiciones, mediante microscopía confocal. Estos resultados han sido publicados en Scientific Reports (Galindo-Moreno M, Giráldez S, Sáez C, Japón MÁ, Tortolero M, Romero F. (2017). Both p62/SQSTM1-HDAC6-dependent autophagy and the aggresome pathway mediate CDK1 degradation in human breast cancer. Scientific Reports 7: 10078). TP53 es el gen que aparece más frecuentemente mutado en los cánceres humanos. Funciona como un sensor de la integridad del genoma y es activado por diferentes formas de estrés celular como la hipoxia, los cambios de pH y, sobre todo, los daños en el ADN. La proteína actúa deteniendo el ciclo celular para la reparación de los daños, o induciendo apoptosis si los daños son irreparables. Nuestro grupo identificó a p53 como un potencial sustrato de SCF(FBXW7) en ensayos de espectrometría de masas. En esta Tesis comprobamos por coinmunoprecipitación directa e inversa que ambas proteínas interaccionan in vivo y que SCF(FBXW7) poliubicuitila a p53 induciendo su degradación. Además, en la secuencia primaria de p53 encontramos hasta 4 posibles CPDs y, mediante mutagénesis dirigida, determinamos cuál de ellos es el responsable de la unión a la ligasa. Ese motivo, y concretamente la serina 33, requiere ser fosforilado por GSK3β para que p53 sea reconocida por SCF(FBXW7) y degradada. Observamos que, en condiciones de cultivo no estresantes, SCF(FBXW7) interviene, pero poco, en la degradación de p53. Por tanto, para averiguar la relevancia de la degradación de p53 debida a FBXW7 estudiamos su papel tras someter a las células a agentes que producen daños en el ADN. Aparentemente, SCF(FBXW7) no participa en la degradación de p53 inmediatamente después de tratar a las células con radiación UV, pero sí contribuye a su degradación a largo plazo, probablemente después de haberse reparados los daños, permitiendo la recuperación de la proliferación celular. Habida cuenta que la presencia de FBXW7 reducía la apoptosis mediada por p53 tras daños en el ADN, examinamos la posible influencia de la amplificación de FBXW7 en la supervivencia de pacientes con distintos tipos de cáncer, utilizando los datos disponibles en las bases de datos de cBioPortal. El análisis de un amplio número de casos de pacientes con tumores de mama que portan TP53 silvestre muestra que la presencia de FBXW7 amplificado disminuye significativamente la supervivencia. Sin embargo, no se encontró diferencia significativa en la supervivencia entre pacientes con TP53 mutado/FBXW7 amplificado y TP53 mutado/FBXW7 silvestre, lo que corrobora que la nueva función de FBXW7 se ejerce a través de p53. Estos resultados están sometidos a publicación.
