The metabolism of diacylglycerol in T cell tolerance regulation and tumor evasion
- Autores: Javier Arranz Nicolás
- Directores de la Tesis: Isabel Mérida De San Román (dir. tes.), Antonia Avila Flores (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Número de páginas: 169
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
- español
El diacilglicerol (DAG) es crucial para desencadenar la activación y diferenciación de las células T. DAG se genera en respuesta a la activación del receptor de células T (TCR) y señales coestimuladoras. La disponibilidad de DAG es crítica para las cascadas de RasGRP1 y PKCθ.
En células T, la abundancia y señalización de DAG está limitada por las isoformas α y ζ de la familia de DAG quinasas (DGK), que lo transforman en ácido fosfatídico y limitan sus funciones.
El uso de las DGK como dianas representa una aproximación prometedora para la manipulación de la respuesta inmune, pero determinar funciones específicas de isoforma es complejo. Hemos dado respuesta a algunos de los resultados contradictorios respecto a la especificidad de isoforma. Usando técnicas de silenciamiento génico por RNA de interferencia, comparamos los efectos de eliminar DGKα/ζ en células Jurkat con aquellos observados en ratones deficientes para DGK. Investigamos estos efectos por debajo del TCR y CD28 mediante el análisis de marcadores de activación por citometría de flujo. Analizamos la fosforilación de proteínas por Western Blot y la activación transcripcional de promotores acoplados a luciferasa. Estos estudios nos permitieron describir un papel predominante de DGKζ en el control del eje PKCθ/PDK-1/AKT.
Las DGK, y especialmente DGKα, se expresan en linfocitos infiltrantes de tumor anérgicos y en tumores. El bloqueo de DGKα reinstaura el ataque a los tumores por las células T y bloquea el crecimiento del tumor. Esto contrasta con la aparente menor contribución de esta isoforma. Para explicar esta discrepancia, realizamos una comparación de los efectos del bloqueo de DGKα con los de su silenciamiento. Comparamos los efectos de los inhibidores de DGK (DGKi) con los de ritanserina, un compuesto análogo, descrito inicialmente como antagonista de los receptores de serotonina. La deficiencia de DGKα resultó en una disminución de la señal, mientras que su inhibición promovió una ganancia de función, igualmente por los DGKi y ritanserina. Todavía se necesita buscar compuestos más específicos. La búsqueda de inhibidores requiere ensayos robustos basados en células en los que se mimeticen las condiciones fisiológicas. Hemos desarrollado diferentes estrategias para testar los compuestos derivados de un cribado de alta capacidad eligiendo DGKα como diana terapéutica. Hemos evaluado los efectos de modular la expresión/actividad de DGKα/ζ en células Jurkat expresando de manera transitoria/estable diferentes mutantes de DGK y/o promotores, así como células T primarias de ratón y humano.
También desarrollamos estudios similares utilizando una línea derivada de las células Jurkat que expresa de manera estable tres promotores acoplados a proteínas fluorescentes, en el contexto de una estimulación derivada del contacto célula-célula. En estas condiciones, DGKα/ζ limitan la señalización de DAG de manera similar, mientras que su contribución a la señalización mediada por calcio es diferente. Finalmente, investigamos la contribución de DGKα a la plasticidad de las células CD4+ utilizando células de ratones transgénicos para el TCR polarizadas hacia fenotipos efectores y reguladores (Treg). La deficiencia de DGKα resultó en una disminución del desarrollo Treg, mientras que las características efectoras fueron favorecidas. La expresión diferencial de esta DGK entre los distintos fenotipos sugiere su potencial como biomarcador en el análisis de las poblaciones T CD4+.
- English
Generation of diacylglycerol (DAG) is crucial to trigger activation and differentiation of T cells.
DAG is generated after the triggering of T cell receptor (TCR) and costimulation. DAG is critical for RasGRP1- and PKCθ-derived signaling pathways. In T cells, DAG abundance and signaling is tempered by the α and ζ isoforms of the DAG kinase (DGK) family, which transform DAG into phosphatidic acid and limit DAG functions. Targeting DGK activity represents a promising approach for therapeutic manipulation of the immune response, but assessment of DGK isoformspecific functions is complex. We addressed these questions and explained some of the contradictory results regarding DGK isoform specificity. Using short interfering RNA-mediated gene silencing, we compared the impact of depleting either DGKα or ζ in Jurkat T cells with those observed in DGK-deficient mice. We investigated these effects downstream of the activation of TCR and CD28 by the analysis of T cell activation markers by flow cytometry, phosphorylation studies by Western Blot and evaluation of the transcriptional activation of different luciferasecoupled promoters. We found that, compared to DGKα, DGKζ predominantly limits the activation of a PKCθ/PDK-1/AKT-dependent axis. DGK, and especially DGKα, are highly expressed in hypofunctional tumor-infiltrating lymphocytes and in tumors. DGKα blockade is shown to reinstate T cell attack on tumors and block tumor cell growth directly. These observations contrast with the apparent minor contribution of this DGK isoform. To answer this discrepancy, we performed a side-by-side comparison of the effects of DGKα blockade with those observed after its depletion.
We compared the effects of DGK inhibitors (DGKi) with those of ritanserin, a structurally analogue compound, initially described as a serotonin receptor antagonist. DGKα deficiency resulted in diminished signaling downstream of costimulatory signals, while its inhibition lead to a gain-offunction effect, equally promoted by DGKi and ritanserin. Although DGKα inhibition represents a potential approach in the treatment of cancer, there is still a need of searching for more specific compounds. The obtainment of reliable inhibitors requires of robust cell-based assays mimicking physiological conditions. We developed different strategies to test the compounds derived from a high throughput screening targeting DGKα. We evaluated the effects of modulating DGKα/ζ expression/activity using Jurkat cells transiently/stably expressing different DGK mutants and/or DAG-responsive promoters, as well as primary mouse and human T cells. We performed similar studies using a Jurkat-derived human T cell line stably expressing three promoters coupled to fluorescent proteins in the context of cell-cell contact-derived stimulation. Under these conditions, DGKα and ζ were shown to similarly limit DAG-dependent pathways but their contribution was observed to be different regarding Ca2+-derived signaling. Finally, we investigated the input of DGKα into CD4+ T cell plasticity using TCR transgenic mouse cells polarized towards effector and regulatory (Treg) phenotypes. DGKα deficiency resulted in a diminished Treg development, whereas effector features were favored. The differential expression of this DGK isoform between the distinct phenotypes suggests the potential use of DGKα as a biomarker in the analysis of CD4+ T cell populations.
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