The role of kv1.3 channels in cell proliferation: mechanisms and molecular determinants
- Autores: Laura Jiménez Pérez
- Directores de la Tesis: José Ramón López López (dir. tes.), Teresa Pérez García (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Valladolid ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Laura Almaraz Gómez (presid.), Ángeles Gómez Niño (secret.), María F. Gómez (voc.), Guillermo Javier Pérez González (voc.), Jose Manuel Fernandez Fernandez (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: UVADOC
- Resumen
1. Introducción Las células de músculo liso vascular (CMLV) son capaces de pasar de un fenotipo contráctil a un fenotipo proliferativo en respuesta a diversos factores o estímulos que actúan sobre el vaso. La proliferación de estas células es importante en todos los estados del desarrollo y es crítica en la reparación tisular frente a diversas lesiones (Owens, 1995). Sin embargo, además de este papel fisiológico, la plasticidad de las CMLV contribuye de forma importante a numerosas patologías cardiovasculares, como la hipertensión, la arteriosclerosis o la restenosis tras angioplastia. En todas estas situaciones existen factores fisiológicos o patológicos que desencadenan la modulación fenotípica de las CMLV, induciendo su desdiferenciación con la expresión de genes que codifican para proteínas reguladoras del crecimiento, la migración y la proliferación celular.
Los cambios coordinados en la expresión de canales iónicos son también un componente integral de esta plasticidad. De hecho, los cambios en la expresión de los canales de K+ se asocian con alteraciones en las propiedades funcionales de las CMLV (Neylon, 2002). En trabajos previos de nuestro grupo generamos un perfil de expresión de 87 genes de canales iónicos de CMLV de arteria femoral de ratón, en fenotipo contráctil y en dos modelos diferentes de proliferación: un modelo in vitro (CMLV en cultivo) y un modelo in vivo (CMLV desdiferenciadas procedentes de lesiones endovascular). Este abordaje permitió identificar cambios en la expresión de los canales iónicos asociados al fenotipo proliferativo en las dos condiciones experimentales estudiadas. Así, se observó una sobreexpresión de dos genes, el canal Kv1.3 y la subunidad accesoria de este canal, Kvß2.1. Por otra parte, se observó además que la expresión y la contribución funcional del canal Kv más abundante en el fenotipo contráctil, el Kv1.5, desaparece tras el cambio fenotípico (Cidad et al., 2010). Estos cambios en la expresión de los canales Kv1.3 y Kv1.5 tras el cambio fenotípico se vieron conservados en otros lechos vasculares de ratón (CMLV de arteria aorta y mesentérica), por lo que postulamos que el cociente entre la expresión de los canales Kv1.3 y Kv1.5 podría constituir un indicador de la modulación fenotípica.
El bloqueo del Kv1.3 con agentes selectivos redujo significativamente la proliferación y la capacidad de migración de las CMLV en cultivo, demostrando que existe una asociación entre el aumento de la expresión funcional de los canales Kv1.3 y la capacidad de proliferación de estas células (Cidad et al., 2010). Estos datos se han descrito también en otros lechos vasculares de ratón (arterias mesentéricas) (Cidad et al., 2012) y en diversos lechos vasculares humanos (Cidad et al., 2014).
A pesar de que existen otros canales cuya expresión y/o función también se han relacionado con un aumento en la proliferación de las CMLV (Miguel-Velado et al., 2010;Kohler et al., 2003), la asociación de estos canales y la proliferación no se ha visto conservada en otros lechos vasculares.
Por tanto, el hecho de que el efecto pro-proliferativo de los canales Kv1.3 se haya descrito en CMLV de diferentes lechos vasculares y especies podría reflejar una asociación de estos canales con el remodelado vascular, pudiendo representar una diana terapéutica.
2. Objetivos El principal objetivo de este trabajo es la caracterización del papel de los canales Kv1.3 en la proliferación celular. Para ello, estudiaremos los determinantes moleculares del Kv1.3 relacionados con la proliferación, así como los mecanismos y las vías de señalización involucradas.
3. Materiales y Métodos Para la realización de los principales experimentos de esta tesis se ha usado la línea celular HEK293. En estas células se han transfectado distintos vectores de expresión mediante Lipofectamina 2000. Los vectores usados son plásmidos bicistrónicos que codifican para Kv1.3 o Kv1.5, proteínas de fusión de ambos canales generadas por PCR, mutantes puntuales del Kv1.3 y canales quiméricos Kv1.3-Kv1.5. Las mutaciones puntuales se han generado usando el kit de mutagénesis dirigida QuikChange (mutantes del poro: Kv1.3-AYA y Kv1.3-W389F, mutante del poro y del sensor de voltaje: Kv1.3-WF3x y mutantes de todos los residuos fosforilables del extremo carboxilo del Kv1.3-(T439A, Y447A, S459A, S470A, S473A, S475A, Y477A, T493A). Las quimeras usadas se han generado bien por PCR convencional (K5N3 y K5C3), mediante alineamiento de oligonucleótidos (K5-613YS) o por PCR de extensión por solapamiento (K5-532YS). Por último, se ha generado también un vector truncado del Kv1.3 (K3YS) mediante alineamiento de oligonucleótidos.
La caracterización de la expresión en membrana de estos mutantes se ha llevado a cabo mediante inmunocitoquímica, mientras que la caracterización funcional y el estudio de la cinética de estos canales se ha realizado con estudios de patch-clamp, usando las conformaciones de whole-cell, parche perforado y cell-attached. La expresión proteica y los cambios en la fosforilación del Kv1.3 se han estudiado por immunoblot. Finalmente, los ensayos de proliferación se realizaron mediante contaje celular y estudiando la incorporación de EdU, un análogo de la timidina que se incorpora durante la fase S del ciclo celular. Con el objetivo de realizar transferencias génicas en CMLV (uterinas, coronarias y renales) se ha iniciado tanto la construcción de vectores lentivirales expresando los canales Kv1.3 y Kv1.5, como la puesta a punto de la transducción de estos vectores en CMLV en cultivo.
4. Resultados Los resultados obtenidos en CMLV han sido validados en un sistema heterólogo como son las células HEK293. La sobreexpresión de Kv1.3 condujo a un aumento significativo de la proliferación celular, mientras que la sobreexpresión de Kv1.5 inhibió la proliferación. El efecto pro-proliferativo del Kv1.3 fue inhibido por bloqueantes selectivos de este canal, como el PAP-1 y la Margatoxina. Además, el estudio de los efectos sobre la proliferación de los mutantes del poro y/o del sensor de voltaje indicó que el efecto pro-proliferativo del Kv1.3 puede ser reproducido por mutantes del poro pero no por un mutante del sensor de voltaje.
Mediante la sobreexpresión de las quimeras K5N3 y K5C3, se determinó que los determinantes moleculares responsables de la proliferación inducida por Kv1.3 residen en el dominio carboxilo. En particular, identificamos dos residuos cercanos (Y447 y S459) cuyas mutaciones inhibieron el efecto del Kv1.3 sobre la proliferación. De hecho, en quimeras del Kv1.5 que contenían el fragmento YS se observó un aumento significativo de la proliferación únicamente cuando este segmento había sido clonado en el sitio análogo del Kv1.3.
El uso del bloqueante PD98059, inhibidor de la vía de señalización de MEK/ERK, redujo la proliferación de manera significativa en células transfectadas con Kv1.3 pero no en células transfectadas con los mutantes Kv1.3-Y447 o Kv1.3-S459. Cuando estudiamos los efectos sobre la fosforilación de la proteína del canal, PD98059 fue capaz de inhibir la fosforilación en tirosinas (p-Tyr) de Kv1.3, no observándose ningún efecto en el mutante Y447A. Al estudiar los niveles de p-Tyr asociados al cambio conformacional del canal, observamos que esta fosforilación aumentaba en aquellas células que habíamos incubado con una alta concentración de potasio extracelular, siendo el efecto visible a tiempos cortos y desapareciendo tras incubaciones prolongadas (2-4 horas). Estos datos se complementan con los obtenidos estudiando la fosforilación del canal en células transfectadas con los mutantes del poro y/o del sensor de voltaje, en los que vemos un aumento en p-Tyr sólo en el mutante Kv1.3-W389F (capaz de percibir el voltaje), pero no en Kv1.3-WF3x, el cual permanece en el estado inactivado. Esto confirma que la respuesta pro-proliferativa se determina por el cambio conformacional del canal. Por último, y con el objetivo de extrapolar los resultados obtenidos en células HEK293 a un sistema nativo, optimizamos un método de transferencia génica en CMLV mediante el uso de lentivirus. Este vehículo de transferencia nos permitió obtener eficiencias de transducción de más del 90 % no sólo en células HEK293 sino en también en CMLV de arteria uterina, renal y coronaria.
5. Discusión y Conclusiones La sobreexpresión de Kv1.3 en un sistema heterólogo (células HEK293) aumenta significativamente la proliferación celular, mientras que la sobreexpresión de Kv1.5 inhibe la proliferación sin inducir apoptosis.
El uso de los mutantes del poro y/o del sensor de voltaje indica que el efecto del Kv1.3 sobre la proliferación de las células HEK293 requiere la expresión en membrana del canal y que éste sea capaz de percibir el voltaje, induciendo cambios conformacionales. Estos resultados sugieren que el Kv1.3 podría ser una proteína bifuncional que no sólo regula el flujo de K+ sino también vías de señalización intracelulares.
La quimera K5C3 presenta efectos pro-proliferativos similares a los del Kv1.3, mientras que la quimera K5N3 inhibe la proliferación al igual que el Kv1.5, demostrando que los efectos de los canales Kv1.3 y Kv1.5 sobre la proliferación están mediados por sus dominios carboxilo.
Entre todos los residuos fosforilables del dominio carboxilo del Kv1.3, sólo las mutaciones en Y447 y S459 abolen completamente el efecto pro-proliferativo del Kv1.3, por tanto estos residuos podrían jugar un papel importante en los mecanismos a través de los cuales el Kv1.3 induce proliferación. De hecho, la quimera K5-532YS, la cual contiene el fragmento YS clonado en el sitio análogo del Kv1.3, es capaz de inducir proliferación. Esto demuestra que la posición de estos residuos es relevante.
Los resultados con el bloqueante de la vía de MEK/ERK (PD98059) y los estudios de los niveles de fosforilación en tirosina demuestran que la activación de la vía de MEK/ERK1/2 modula la fosforilación del residuo Y447, el cual es un determinante importante de la vía de señalización a través de la cual el Kv1.3 induce proliferación. Además, la fosforilación de Y447 se observa en el Kv1.3 y en el mutante del poro Kv1.3-W389F, pero no en el mutante del poro y el sensor del voltaje: Kv1.3-WF3x, el cual permanece en un estado inactivado. Estos resultados indican que los cambios conformacionales del canal son los responsables de determinar la accesibilidad de estos residuos, desencadenando así la vía de señalización mediante la cual el Kv1.3 induce proliferación.
Por último, el uso de vectores lentivirales como herramienta de transferencia génica en CMLV representa una buena técnica para manipular los niveles de expresión de los canales Kv1.3 y Kv1.5 en cultivos primarios y estudiar los efectos de estos mutantes.¿
