Evaluación de los efectos toxicogenómicos y genotóxicos de la Vinclozolina en invertebrados acuáticos

• Autores: Mónica Aquilino Amez
• Directores de la Tesis: José Luis Martínez Guitarte (dir. tes.), Paloma Sánchez Argüello (dir. tes.)
• Lectura: En la UNED. Universidad Nacional de Educación a Distancia ( España ) en 2018
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Carles Barata Martí (presid.), Mónica Morales Camarzana (secret.), Sofia Isabel Antunes Guiherme (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias por la Universidad Nacional de Educación a Distancia
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    El objetivo general del presente trabajo, ha sido evaluar el efecto toxicogenómico y genotóxico del plaguicida Vinclozolina (Vz) en invertebrados acuáticos. Se ha demostrado que la Vz actúa como disruptor endocrino con actividad anti-androgénica en mamíferos. Se han descrito así mismo sus efectos en la reproducción de organismos acuáticos (peces e invertebrados), aunque no se conoce el mecanismo de acción en estos últimos. En esta tesis doctoral se ha trabajado con dos especies de invertebrados, un insecto díptero (Chironomus riparius) y dos de sus fases del ciclo de vida (embriones y larvas) y la fase adulta de un molusco de agua dulce (Physa acuta), con el objetivo de avanzar en el conocimiento sobre el mecanismo de acción de la Vz en invertebrados. El estudio de los efectos toxicogenómicos de la Vz se llevó a cabo tras tratamientos agudos mediante el análisis de cambios en la expresión de genes relacionadas con distintos procesos fisiológicos: sistema endocrino (EcR, E74, Kr-h1, DIS, Cyp18a1, FOXO, MAPR, INR, MET, ER), respuesta celular de estrés (Hsp16.6, Hsp17, Hsp20.4, Hsp24, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Gp93, Cu/Zn SOD), metabolismo de xenobióticos (Cyp4G, Cyp2U1, Cyp3A7, Cyp4F22, GSTt2, GSTo1, GstD3, y MRP1-ABC) y mecanismos de reparación del ADN (ATM, ATR, CASP3, DECAY, NLK, RAD-1, XRCC-1, XRCC-2 y XRCC- 4). Este último (estudio toxicogenómico sobre mecanismos de reparación del ADN) se completó con el ensayo cometa para conocer el daño en el ADN por rotura de doble hebra. Finalmente, los efectos de la Vz en la reproducción se valoraron en C. riparius mediante la exposición crónica de larvas hasta la emergencia de la fase adulta (mosquitos) en sistemas agua-sedimento. La Vz no afecta a la supervivencia de larvas de C. riparius ni de adultos de P. acuta. Sin embargo, sí afecta al desarrollo de embriones de C. riparius, y de manera más severa cuando la generación parental es previamente expuesta. Por otro lado, no se observaron efectos en el ensayo de reproducción de C. riparius salvo una tendencia no significativa a aumentar la fecundidad a medida que aumenta la concentración de Vz. Los resultados obtenidos para la expresión génica tanto de embriones como de larvas de C. riparius demostraron un efecto en el sistema endocrino a nivel de regulación hormonal alterando la expresión de EcR, E74, MET, MAPR y FOXO y, al mismo tiempo, modificando el metabolismo de la ecdisona como refleja DIS y Cyp18a1. Sin embargo, el único receptor hormonal analizado en P. acuta (ER) no experimentó cambios en su expresión tras la exposición a Vz.Por otro lado, los resultados observados para la respuesta a estrés celular tanto en embriones como en larvas de C. riparius mostraron una activación de la Hsp40, Hsp24 y Hsp70. Además de la activación de mecanismos de destoxificación (Cyp4G). Nuevamente, P. acuta mostró un comportamiento diferente ya que se observó la inhibición de Hsp20.4 y no hubo activación de ninguno de los genes estudiados relacionados con los procesos de destoxificación. El ensayo cometa demostró en ambas especies la capacidad de la Vz para inducir daño en el ADN, aunque solo se observó una relación dosis-respuesta significativa para todos los parámetros analizados (porcentaje de ADN en cola, longitud de la cola, momento cola, momento oliva) en el caso de C. riparius. Por último, la sobreexpresión de genes involucrados en mecanismos de reparación del ADN (ATM y XRCC-1) observada en C. riparius demuestra que este organismo es capaz de activar dichos mecanismos, mientras que en el caso de P. acuta se observó una inhibición para el mismo gen o un análogo (ATM y XRCC-2). En esta tesis doctoral se han comprobado los efectos genotóxicos de la Vz en insectos y moluscos acuáticos, relacionándose por primera vez con la actividad transcripcional de genes involucrados en mecanismos de reparación del ADN. Los resultados permiten concluir que la Vz puede alterar genes clave en la ruta de señalización mediada por ecdisona y otras rutas hormonales, sugiriendo así una interacción directa de este contaminante con el sistema endocrino de insectos. Del mismo modo, se confirma la activación de dianas de estrés celular y de rutas de destoxificación en este grupo de invertebrados. La falta de respuesta observada en genes de ruta endocrina, estrés celular y detoxificación observada en P. acuta, ponen de manifiesto la necesidad de continuar explorando otras dianas moleculares para moluscos en el estudio del mecanismo de acción de disruptores endocrinos. Finalmente, estos resultados ponen de relieve la necesidad de utilizar distintas dianas moleculares en varias especies representativas de distintos taxones de invertebrados en el estudio del mecanismo de acción de disruptores endocrinos.

  • English

    The general objective of this work was to evaluate the toxicogenomic and genotoxic effects of the pesticide Vinclozolin (Vz) in aquatic invertebrates. It has been shown that Vz acts as an endocrine disruptor with anti-androgenic activity in mammals. Its effect on the reproduction of aquatic organisms (fish and invertebrates) has also been described, although via an unknown mechanism. In this doctoral thesis, I worked with two species of invertebrates (embryo and larva of the dipteran insect Chironomus riparius and the adult phase of the freshwater mollusk Physa acuta), with the objective of improving our knowledge of the mechanism of action of Vz in invertebrates. The toxicogenomic effects of Vz were determined following acute exposure by analysis of the expression of genes related to different physiological processes: endocrine system (EcR, E74, Kr-h1, DIS, Cyp18a1, FOXO, MAPR , INR, MET, ER); cellular stress response (Hsp16.6, Hsp17, Hsp20.4, Hsp24, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Gp93, Cu/Zn SOD); xenobiotic metabolism (Cyp4G, Cyp2U1, Cyp3A7, Cyp4F22, GSTt2, GSTo1, GstD3, MRP1-ABC); and DNA repair mechanisms (ATM, ATR, CASP3, DECAY, NLK, RAD-1, XRCC-1, XRCC-2 and XRCC-4). To study the impact of Vz on DNA repair mechanisms, the comet assay was used to determine the DNA damage induced by double-strand breakage. Finally, the effects of Vz on reproduction were evaluated in C. riparius through the chronic exposure of larvae until emergence of the adult phase in water-sediment systems. Although Vz did not affect the survival of larvae of C. riparius or adults of P. acuta, it does affect the development of C. riparius embryos, and more severely when the parental generation was previously exposed. However, no effect was observed in the reproduction test of C. riparius except for a non-significant tendency to increase fecundity as the concentration of Vz increased. Gene expression results in both embryos and larvae of C. riparius demonstrated endocrine system effects at the level of hormonal regulation, by altering the expression of EcR, E74, MET, MAPR, FOXO and at the same time modifying the metabolism of ecdysone as reflected by DIS and Cyp18a1. However, the only hormone receptor analyzed in P. acuta (ER) did not experience changes in its expression after exposure to Vz. On the other hand, the results observed for the response to cellular stress in both embryos and larvae of C. riparius showed an activation of Hsp40, Hsp24 and Hsp70, and additionally the activation of detoxification mechanisms (Cyp4G). Again, P. acuta showed a different behavior, with inhibition of Hsp20.4 and a lack of activation of any of the genes related to detoxification processes. Comet assays demonstrated the ability of Vz to induce DNA damage in both test species, although a significant dose-response relationship for all analyzed parameters (percentage of DNA in tail, length of tail, tail moment and olive moment) was only found in the case of C. riparius. Finally, the upregulation of genes involved in DNA repair mechanisms (ATM and XRCC-1) observed in C. riparius demonstrates that this organism is capable of activating said mechanisms, while in the case of P. acuta, an inhibition was observed for the analogous genes ATM and XRCC-2. In this doctoral thesis, the genotoxic effects of Vz on aquatic insects and mollusks were verified, for the first time linking them to the transcriptional activity of genes involved in DNA repair mechanisms. The results allow us to conclude that Vz can alter key genes in the ecdysone-mediated signaling pathway, suggesting a direct interaction of this contaminant with the endocrine system of insects. In the same way, activation of cell stress targets and detoxification pathways in this group of invertebrates was confirmed that Vz can alter key genes in the ecdysone-mediated signaling pathway of C. riparius. The lack of change in endocrine pathway genes, cellular stress and detoxification observed in P. acuta brings to light the need to continue exploring other molecular targets that may play a role in the mechanism of action of endocrine disruptors in mollusks. Finally, these results highlight the necessity of using different molecular targets in various representative species from different invertebrate taxa during such studies.