Biological control of quarantine bacterial plant diseases with lactobacillus plantarum strains. Improvement of fitness and monitoring
- Autores: Núria Daranas
- Directores de la Tesis: Esther Badosa Romaño (dir. tes.), Anna Bonaterra Carreras (codir. tes.), Emilio Montesinos Seguí (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Girona ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Concepció Moragrega García (presid.), Ester Marco Noales (secret.), Jaime Cubero (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Tecnología por la Universidad de Girona
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
El fuego bacteriano del manzano y el peral, en chancro bacteriano del kiwi, la mancha bacteriana de los frutales de hueso y la mancha angular de las hojas de fresa son enfermedades que causan importantes pérdidas en los cultivos de fruta en todo el mundo debido a que las opciones disponibles para su control tienen una eficacia limitada. Los agentes causales (Erwinia amylovora, Ea; Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa; Xanthomonas arboricola pv. pruni, Xap; y Xanthomonas fragariae, Xf, respectivamente) son bacterias fitopatógenas consideradas organismos de cuarentena por la Organización Europea y Mediterránea de Protección Vegetal (EPPO) y la Unión Europea. El número limitado de productos químicos eficaces, la creciente evolución de poblaciones de patógenos resistentes a los bactericidas existentes, así como la preocupación social por el impacto negativo de los plaguicidas convencionales sobre el medio ambiente y la salud humana han fomentado el desarrollo de herramientas de control alternativas y sostenibles. Concretamente, el control biológico mediante el uso de bioplaguicidas microbianos es una estrategia alternativa que forma parte del manejo integrado de enfermedades de plantas.
Mientras que algunos microorganismos están disponibles en el mercado como agentes de biocontrol (ABC) del fuego bacteriano, actualmente hay poca información sobre microorganismos antagonistas para el control biológico del chancro bacteriano del kiwi, la mancha bacteriana de los frutales de hueso y la mancha angular de las hojas de fresa.
Esta tesis doctoral contribuye en el desarrollo de un nuevo bioplaguicida microbiano basado en bacterias del ácido láctico (BAL) con actividad de amplio espectro. Las BAL son ampliamente conocidas como bioconservantes en alimentos y su potencial uso en protección de cultivos también ha sido explorado, aunque en menor medida. Además, las BAL forman parte de la microbiota de las plantas y generalmente están calificadas como seguras para las agencias de seguridad alimentaria.
En la primera parte de esta tesis doctoral se evaluó el antagonismo in vitro de BAL contra Psa, Xap y Xf. Las cepas Lactobacillus plantarum CC100, PM411 y TC92 y Leuconostoc mesenteroides CM160 y CM209 se seleccionaron por su actividad de amplio espectro. Las cepas seleccionadas se estudiaron con mayor detalle mediante ensayos de biocontrol en condiciones de invernadero en plantas de kiwi, Prunus sp. y fresa. L. plantarum PM411 y TC92 previnieron las infecciones de Psa, Xap y Xf en las correspondientes plantas huéspedes. En los experimentos de semi-campo y campo realizados, la eficacia de ambas cepas fue comparable con productos de referencia. Por lo tanto, la aproximación multifactorial basada en ensayos in vitro e in planta frente a múltiples patógenos permitió seleccionar L. plantarum PM411 y TC92 como candidatos ABC. El mecanismo implicado en su actividad antibacteriana in vitro se basa, al menos en parte, por el efecto de la reducción de pH y la producción de ácido láctico. Además, ambas cepas presentaron similares tasas de supervivencia en la superficie de las hojas. Las cepas L. plantarum PM411 y TC92 se diferenciaron claramente con los perfiles obtenidos mediante las técnicas “multilocus sequence typing” (MLST) y “random amplified polymorphic DNA” (RAPD).
El establecimiento de los ABC, y también de las BAL, en las superficies de la parte aérea de las plantas, donde muchos patógenos crecen de manera epífita, es un factor clave en el control biológico. La parte aérea de las plantas se considera generalmente un ambiente hostil para la colonización bacteriana debido a la radiación ultravioleta, la limitación de nutrientes y las fluctuaciones de temperatura y disponibilidad de agua. Con el fin de mejorar la aptitud epífita de L. plantarum PM411 y TC92, en la segunda parte de esta tesis doctoral se incrementó la tolerancia al estrés por déficit de agua mediante una estrategia de adaptación fisiológica que consiste en hacer crecer las células en un medio hiperosmótico hasta alcanzar la fase estacionaria, que conlleva la producción de ácido. Las células adaptadas presentaron mayores niveles de supervivencia frente a la desecación in vitro que las no adaptadas. La respuesta de PM411 y TC92 al tratamiento de adaptación implicó un incremento de los niveles de transcripción de genes relacionados con el estrés, los cuales, en general, permanecieron inalterados durante la posterior desecación. Aun así, se observaron diferencias entre los patrones de transcripción de las dos cepas coincidiendo con un mejor comportamiento de las células adaptadas de PM411 que las de TC92 en las plantas en condiciones de baja humedad relativa. El tratamiento de adaptación incrementó la supervivencia de PM411 en condiciones de invernadero (hojas de fresa y kiwi) y de campo (flores de manzano y peral). Además, el tratamiento de adaptación aportó a la cepa PM411 mayor consistencia en el biocontrol de las infecciones de Ea en flores de manzano y peral y de Xf en hojas de fresa.
Los métodos de monitorización que permiten la detección específica a nivel de cepa y la cuantificación de células viables son necesarios para distinguir la cepa del ABC introducida de la microbiota autóctona de la misma especie, y para evaluar sus dinámicas poblacionales en las superficies de las plantas después de la aplicación en campo. En la última parte de esta tesis se desarrolló un método basado en la PCR cuantitativa de viables (v-qPCR) para la detección y cuantificación de células viables de L. plantarum PM411. Este método se basaba en un pretratamiento de la muestra con un colorante que se intercala con el DNA previo a la técnica de qPCR. El agente intercalante PEMAX se utilizó para detectar y enumerar solamente células viables mediante qPCR. Se identificó un marcador molecular específico de la cepa PM411 en una región de un posible profago con arquitectura de mosaico. Se diseñaron tres ensayos de qPCR con amplicones de distintas longitudes (92, 188 y 317 pb), siendo el que amplificaba un fragmento de 188 pb el más apropiado para el método v-qPCR. La idoneidad de la técnica v-qPCR juntamente con la del recuento en placa y qPCR en la monitorización de la población de PM411 en la superficie de plantas (hojas de peral, fresa y kiwi y flores de manzano y peral) se evaluó de manera simultánea en condiciones de invernadero y campo. Los tres métodos contribuyeron en la comprensión del comportamiento de la cepa PM411 en distintos órganos, especies de plantas y condiciones ambientales. La población estimada con los tres métodos no difirió significativamente cuando las condiciones eran favorables para la supervivencia de PM411. Por lo contrario, en condiciones de estrés, se observaron diferencias entre los métodos debido a la muerte celular o a la inducción del estado de viables pero no cultivables. En estos casos la técnica de qPCR sobreestimó el nivel poblacional de viables de PM411 mientras que el recuento en placa lo subestimó.
