Resumen de Configuración de una estrategia para la identificación genético-molecular de pacientes con enfermedad mitocondrial
Las enfermedades mitocondriales (EM) son un grupo de enfermedades hereditarias del metabolismo, caracterizadas por la alteración de la función mitocondrial, que en la mayor parte de los casos se deben a trastornos del sistema de la fosforilación oxidativa. Este grupo de enfermedades es muy heterogéneo tanto clínica como genéticamente, debido a su origen genético dual (pueden producirse por mutaciones tanto en el genoma nuclear como en el genoma mitocondrial) y a su gran variabilidad fenotípica (puede estar afectado un solo órgano o la afectación puede ser multisistémica). En estas enfermedades, en muchas ocasiones no hay correlación genotipo-fenotipo, una misma mutación produce fenotipos distintos, y mutaciones en distintos genes producen el mismo fenotipo. Este hecho dificulta el diagnóstico genético de estas enfermedades.
La hipótesis de esta tesis es que la aplicación de las técnicas de secuenciación masiva (NGS) en el diagnóstico de las EM mejorará la eficacia de su diagnóstico. La aplicación de la NGS en estas enfermedades podrá detectar nuevas variantes patogénicas en genes conocidos, asociar nuevos fenotipos a genes ya descritos implicados en EM, así como descubrir nuevos genes causantes de estas enfermedades ampliando el espectro feno-genotípico, así como optimizar el rendimiento diagnóstico.
En este trabajo se ha integrado la secuenciación masiva en el diagnóstico de pacientes con EM, tanto en la secuenciación del genoma mitocondrial como en genes nucleares. Se ha puesto a punto y validado la secuenciación del ADN mitocondrial (ADNmt) completo, que ha permitido detectar bajos niveles de heteroplasmia del ADNmt. Además, se ha optimizado la homogeneidad de la cobertura en toda la molécula del ADNmt. Esta metodología ha permitido delimitar en los casos de deleciones únicas del ADNmt la región delecionada. Se ha diseñado y validado un panel de genes a la carta, relacionados con el mantenimiento del ADNmt para su uso diagnóstico. En pacientes con EM también se ha estudiado el exoma clínico (n=8) y el exoma completo (n=9). Se han caracterizado las nuevas variantes potencialmente patogénicas encontradas, tanto en el ADN mitocondrial como en genes nucleares y se han estudiado posibles variantes modificadoras del fenotipo en pacientes con sordera neurosensorial no sindrómica portadores de la variante m.1555A>G en MTRNR1 en homoplasmia.
La aplicación de las técnicas de secuenciación masiva en el diagnóstico de estas enfermedades ha obtenido un alto rendimiento diagnóstico, sobre todo en aquellos enfermos bien caracterizados clínicamente. La secuenciación del ADNmt ha permitido la detección de variantes patogénicas en muy bajo porcentaje de heteroplasmia, no detectadas por secuenciación Sanger, en muestras de ADN procedente de sangre periférica, hecho que ha permitido el diagnóstico de estos pacientes sin necesidad de realizar una biopsia muscular. El estudio de secuenciación del ADNmt completo ha detectado variantes patogénicas no asociadas previamente a los fenotipos de los pacientes. La aplicación del panel de genes relacionados con el mantenimiento del ADNmt ha tenido un buen rendimiento sobre todo en los pacientes que presentaban deleciones múltiples del ADN mitocondrial, siendo el gen POLG en el que se han encontrado en mayor proporción en estos pacientes. El estudio del exoma clínico en pacientes que presentaban síndrome de Leigh ha permitido diagnosticar genéticamente a 2 de los 6 pacientes estudiados. En dos de los pacientes estudiados con exoma con déficit multienzimático del sistema de fosforilación oxidativa se han encontrado variantes posiblemente patogénicas. En un paciente en un gen previamente descrito asociado a fenotipo clínico (YARS2) y en el otro paciente en un gen mitocondrial de función conocida no asociado hasta el momento a patología. Además, en algunas de las nuevas variantes encontradas, se ha podido caracterizar funcionalmente su patogenicidad, asociándolas al fenotipo del paciente.
