Regulación de la homeostasis de Ca2+ y viabilidad celular por STIM1 en la línea de neuroblastoma SH-SY5Y
- Autores: Carlos Pascual Caro
- Directores de la Tesis: Francisco Javier Martín Romero (dir. tes.), Eulalia Pozo Guisado (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Extremadura ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Número de páginas: 197
- Tribunal Calificador de la Tesis: Alejandro Alfredo Rojas Fernández (presid.), Ana Belén Pérez Oliva (secret.), Christophe Lachaud (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomarcadores de Salud y Estados Patológicos por la Universidad de Extremadura
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Dehesa
- Resumen
- español
En esta Tesis Doctoral se ha descrito el papel de STIM1, uno de los principales mediadores de la entrada extracelular de Ca²⁺ (SOCE), en la regulación de la homeostasis de Ca²⁺ y viabilidad celular de la línea de neuroblastoma SH-SY5Y. Para realizar este estudio se ha generado una línea STIM1 knock-out y, por tanto, defectiva en SOCE, mediante el sistema de edición genómica CRISPR/Cas9. Nuestros resultados demuestran que STIM1 no es esencial para la diferenciación de células SH-SY5Y. Sin embargo, se observa una pérdida de viabilidad celular durante la diferenciación de las células deficientes en STIM1. En este sentido, nuestros resultados indican que las células STIM1-KO muestran una mayor expresión y entrada de Ca²⁺ a través del canal Caᵥ1.2, lo cual se traduce en una alteración de la homeostasis de Ca²⁺ intracelular desencadenando una pérdida de la funcionalidad mitocondrial y un incremento de la muerte celular. El silenciamiento génico del canal Caᵥ1.2 logró normalizar la viabilidad y funcionalidad mitocondrial a niveles basales, confirmando que la sobreactivación de Caᵥ1.2 es la principal causa de la muerte celular observada en células STIM1-KO. Por otro lado, nuestros resultados indican que STIM1 es clave en la transferencia de Ca²⁺ entre el retículo endoplasmático y la mitocondria, en un control mediado por el receptor de IP₃ tipo 3. Todo ello permite concluir que STIM1 es clave en el mantenimiento de la homeostasis de Ca²⁺ intracelular y que las células STIM1-KO constituyen un modelo in vitro útil para comprender el papel de STIM1 y la señalización por Ca²⁺ intracelular en la neurodegeneración.
Por último, debido a la disminución de la [Ca2+]mito observada en las células STIM1-KO, se estudió la posible alteración de la transferencia de Ca2+ entre el RE y la mitocondria, una ruta de vital importancia para un correcto tamponamiento de Ca2+, así como para el mantenimiento de la señalización mediada por Ca2+. En este sentido, las células STIM1-KO mostraron una fuerte disminución de expresión y actividad del receptor ITPR3 (también conocido como IP3R3), así como una reducción de expresión del uniportador de Ca2+ mitocondrial MCU en células diferenciadas, que sugieren una disminución en la captación de Ca2+ por parte de la mitocondria. La sobre-expresión del receptor ITPR3 en células STIM1-KO contribuyó a la normalización de la [Ca2+]mito de manera significativa, lo que demuestra que STIM1 controla, al menos de forma indirecta, los niveles de ITPR3, y por tanto, el nivel de [Ca2+]mito. Así los estudios desarrollados en esta Tesis Doctoral establecen que las células STIM1-KO constituyen un modelo in vitro útil para estudiar el papel que juega la desregulación de la señalización y homeostasis del Ca2+ en enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, aunque se requiere más experimentación para determinar hasta qué punto este sistema STIM1-KO puede simular la neurodegeneración in vivo observada en pacientes.
- English
The role of STIM1, one of the main mediators of the extracelular entry of Ca²⁺ (SOCE), in the regulation of Ca²⁺ homeostasis and cell viability of the SH-SY5Y neuroblastoma line, has been described in this Doctoral Thesis. To carry out this study, a STIM1 knock-out and therefore a SOCE-defective cell line has been generated using the CRISPR/Cas9 genomic editing system. Our results show that STIM1 is not essential for SH-SY5Y cell differentiation. However, a loss of cell viability is observed during differentiation of STIM1- deficient cells. In this regard, our results indicate that STIM1-KO cells show a greater expression and Ca²⁺ entry through the Caᵥ1.2 channel, which leads to an alteration of the intracellular Ca²⁺ homeostasis, triggering a loss of mitochondrial functionality and an increase in cell death. Gene silencing of the Caᵥ1.2 channel normalised mitochondrial viability and functionality, confirming that the upregulation of Caᵥ1.2 is the main cause of cell death observed in STIM1-KO cells. On the other hand, our results indicate that STIM1 is a key regulator in the transfer of Ca²⁺ between the endoplasmic reticulum and the mitochondria, a role mediated by the IP3 type 3 receptor. All this allows us to conclude that STIM1 shows a key role in the maintenance of intracellular Ca²⁺ homeostasis and that STIM1-KO cells constitute a useful in vitro model to understand the role of STIM1 and intracellular Ca²⁺ signalling in neurodegeneration.
- español
