Análisis de la función de los factores de transcripción sp6 y sp8 en el ectodermo de la extremidad

• Autores: Rocío Pérez Gómez
• Directores de la Tesis: María Ángeles Ros Lasierra (dir. tes.), Juan Francisco López Giménez (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Cantabria ( España ) en 2018
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Analysis of the function of SP6 and SP8 transcription factors in the limb ectoderm
• Tribunal Calificador de la Tesis: Matthew Towers (presid.), Endika Haro Gabicagogeascoa (secret.), Ana Talamillo Cancelo (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad de Cantabria
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: UCrea
• Resumen
  • español

    Una pregunta fundamental en biología es cómo un grupo de células aparentemente uniformes son capaces de diferenciarse y formar un órgano complejo y funcional en tres dimensiones. La extremidad de los vertebrados ha sido usada ampliamente en estudios genéticos y de desarrollo, ya que es un órgano no vital que puede ser fácilmente manipulado sin comprometer la supervivencia del embrión.

    La formación de la extremidad comienza con la acumulación de células de la placa mesodérmica lateral, emergiendo inicialmente la extremidad como una protuberancia, el esbozo de la extremidad. Este esbozo está compuesto por una masa mesodérmica recubierta por una capa ectodérmica. Las interacciones entre los componentes del mesodermo y los componentes del ectodermo son las responsables de la correcta morfología y desarrollo de la extremidad. En la parte más distal del esbozo se produce un engrosamiento del ectodermo, formándose una estructura especializada llamada cresta ectodérmica apical (AER). Curiosamente la AER se forma en el límite DV y es uno de los principales centros señalizadores que controla el crecimiento a lo largo del eje PD a través de los FGFs. La correcta formación de patrón de la extremidad la llevan a cabo los centros señalizadores, que junto con la AER son la zona de actividad polarizadora (ZPA), controlando la formación del eje AP y el ectodermo no-AER, que controla la formación del patrón en el eje DV.

    La importancia de la AER radica en la truncación de la extremidad cuando ésta es dañada o extirpada. Entender los mecanismos que dirigen la formación de la AER y su precisa y enigmática localización en el límite DV es de máximo interés. Su establecimiento está dirigido por complejas interacciones entre los componentes de 3 vías principales: BMP, WNT/β-CANTENIN y FGFs, que actúan tanto en el ectodermo como entre el ectodermo y el mesodermo.

    Previamente en el laboratorio se identificó que SP6 y SP8, dos factores de transcripción (TF) miembros de la familia Specifity Protein (SP) expresados en el ectodermo de la extremidad, son conjuntamente necesarios para la formación de la AER. SP6 y SP8 son factores redundantes dependientes de dosis y su pérdida conlleva a diversas malformaciones que van desde una sindactilia, pasando por el síndrome de Split-Hand/Foot malformation (SHFM, síndrome de la mano hendida), truncación y finalmente amelia. El fenotipo de SHFM se produce cuando solo hay una copia de Sp8 en ausencia de Sp6 (Sp6-/-; Sp8+/-) y es un fenotipo reminiscente al que se observa en casos humanos. Esta malformación se caracteriza por presentar defectos en la AER, así como una alteración en el eje DV presentando extremidades bidorsales. La caracterización molecular de los dobles mutantes determinó la necesidad de SP6/8 en la inducción de Fgf8 (marcador por excelencia de la AER) mediada por WNT/β-CANTENIN, así como en la activación de En1 (factor ventralizador), viéndose altamente reducido en los mutantes mientras que Wnt7a (factor dorsalizador) se encontró expresado no solo en la zona dorsal sino también en la ventral.

    SP6 y SP8 son por tanto importantes factores que están operando en el ectodermo de la extremidad, tanto en el eje PD como en el DV. El primer objetivo de este trabajo es entender la compleja red reguladora de SP8 que opera en el ectodermo de la extremidad mediante la identificación de las dianas de SP8. Para ello, hemos combinado el perfil de unión de SP8 al genoma (ChIPmentación) y su perfil transcripcional (RNA-seq). Los genes diana directos de SP8 son definidos como aquellos genes que se encuentran diferencialmente expresados en ausencia de Sp8 y están asociados a regiones del genoma unidas por SP8. Ambos estudios se han realizado exclusivamente en los ectodermos de FL a E10.5, estadío en el que la AER presenta su máxima actividad, coincidiendo con el inicio del fenotipo de Sp8.

    Para la ChIPmentación, debido a la ausencia de un anticuerpo anti-SP8 lo suficientemente específico, generamos un ratón Sp8-FL, que contiene el alelo Sp8 tagueado con tres copias del epítopo FLAG. El perfil de unión de SP8 identificó 1,451 regiones. Paralelamente el perfil transcripcional de SP8 fue generado comparando a E10.5 ectodermos WT con ectodermos carentes de Sp8, identificando 892 genes diferencialmente expresados. La combinación de ambos conjuntos de datos reveló 184 genes diana de SP8, estando el 30% reprimidos y el 70% activados por SP8. Esta red de dianas directas de SP8 incluye todos los reguladores importantes en el modelado del ectodermo de la extremidad. El análisis de estos genes reveló que SP8 actúa sobre los genes diana preferentemente desde sitios de unión situados distalmente (>5 kb desde el TSS). La búsqueda de motivos de novo identificó la caja GC conservada en la familia SP (SP1-like) cuando SP8 actúa preferencialmente como represor. Sin embargo, predominan motivos ricos en AT (DLX5-like) cuando SP8 funciona como activador. De acuerdo con ello, comprobamos mediante CoIP en células HEK-293 que SP8 se puede unir físicamente a DLX5. Nuestros resultados sugieren que SP8 controla la transcripción de Fgf8 mediante la unión directa a cajas GC en su promotor, así como que las dianas de la vía de WNT dependientes de SP8 son probablemente mediadas por el control de la expresión de Rspo2. En relación con el eje DV, nuestros resultados indican que SP8 activa tanto a En1 como a Wnt7a a través de enhancers putativos localizados distalmente. Podemos concluir que la actividad transcripcional de SP8 es compleja y puede funcionar directa o indirectamente para activar o reprimir genes diana dependiendo del contexto.

    El segundo objetivo de este trabajo dada la redundancia de SP6 y SP8 es investigar su posible interacción a nivel de proteína. Mediante estudios de Complementación Fluorescente Bimolecular (BiFC) y Coinmunoprecipitación en células HEK-293 identificamos que SP6 y SP8 forman homo y heterodímeros, siendo el dominio de los dedos de zinc de SP8 esencial para esta interacción.

  • English

    SP6 and SP8 are important factors operating in the limb ectoderm at a crossroad between proximo-distal and dorso-ventral patterning. The aim of the present thesis is to understand the complexity of the SP8 dependent regulatory networks operating in the limb ectoderm. Therefore, combination of genome-wide ChIP-seq and RNA-seq analyses were performed for the identification of SP8 target genes. Our results suggest that SP8 transcriptional activity is complex and can work directly (GC boxes) or indirectly (though DLX5) to activate or repress target genes depending on the context.

    As SP6 and SP8 are functionally equivalent and work in concert during limb development we investigated their possible protein‐protein interactions by Co-Immunoprecipitation and Bimolecular Fluorescent Complementation essays in HEK293 cells. We found that SP6 and SP8 can form homo and heterodimers through the zinc finger domain of SP8.