Producción enzimatíca de l-aminoácidos ópticamente puros mediante resolución cinética dinámica
- Autores: Pablo Soriano Maldonado
- Directores de la Tesis: Francisco Javier las Heras Vázquez (dir. tes.), Sergio Martinez Rodriguez (codir. tes.), Josefa María Clemente Jiménez (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Almería ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Lucas del Castillo Agudo (presid.), Antonio Valverde García (secret.), Marta Susana Dardanelli (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Como componentes básicos de la vida, los aminoácidos han jugado un papel muy importante en la nutrición humana y animal, así como en el mantenimiento de la salud. A causa de su funcionalidad y de sus características especiales derivadas de su quiralidad, esta clase de compuestos tienen un gran interés bioquímico y son también de interés en la industria química. Concretamente, algunos L-aminoácidos naturales son utilizados como potenciadores del sabor de alimentos, edulcorantes y precursores de fármacos en la industria cosmética.
De los 20 aminoácidos proteinogénicos (que forman parte de las proteínas), 9 de ellos (L-valina, L-leucina, L-isoleucina, L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-histidina, L-fenilalanina, y L-triptófano) ocupan una posición clave ya que, siendo esenciales para la vida, no pueden ser sintetizados por los animales y los seres humanos, teniendo que ingerirse a través de la alimentación. En términos de volumen de mercado, el desarrollo en las últimas décadas de los llamados aminoácidos de alimentación (L-lisina, DL-metionina, L-treonina y L-triptófano), constituyen una proporción mayor del 50 % del mercado total de aminoácidos. Otros estudios realizados por la Comunicación de la Empresa de Negocios, muestran que se espera que el mercado de los aminoácidos en EE.UU crezca hasta casi 2.000 millones de dólares en 2018, una tasa de crecimiento anual del 4,5 %.
El resto de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos tienen aplicación como fármacos, cosméticos y en agricultura, siendo materias primas ideales para la síntesis de compuesto quirales activos.
En las últimas décadas, el uso de enzimas o de sistemas de célula completa como biocatalizadores ha demostrado ser particularmente valioso en la producción de L-aminoácidos, D-aminoácidos y derivados de aminoácidos enantioméricamente puros con importantes aplicaciones en el sector cosmético, farmaceútico y agrícoIa. Por ejemplo, la L-homofenilalanina es un precursor de la preparación de fármacos inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), como enalaprilo, lisinoprilo, quinaprilo, ramiprilo, trandolaprilo o benazeprilo. Otro ejemplo interesante es el ácido L-2-aminobutírico (L-ABA), que es un intermedio del oftalmalato, un indicador sensible de la disminución del glutatión hepático (GSH) y es usado como marcador para el estrés oxidativo. Es también un intermedio quiral clave para la síntesis de fármacos como levetiracetam o brivaracetam (antiepilépticos) y etambutol (fármaco usado contra la tuberculosis).
Hasta la fecha, se han descrito diversos métodos enzimáticos para la producción de L-aminoácidos ópticamente puros, como los procesos de la ¿Hidantoinasa¿, ¿Amidasa¿ y ¿Acilasa¿. Estos métodos aprovechan la enantioespecificidad o enantioselectividad de al menos una de las enzimas involucradas en el proceso, para obtener D- o L-aminoácidos a partir de sustratos racémicos. Por ejemplo, en el Proceso de la Acilasa, una N-acetil-aminoácido racemasa (NAAAR; asignada recientemente como N-succinil-aminoácido racemasa, NSAAR) se acopla con una D- o L-aminoacilasa para producir D- o L-aminoácidos ópticamente puros, llevándose a cabo una racemización ¿in situ¿ del enantiómero que no es reconocido por la aminoacilasa. La resolución cinética del N-acetil-D,L-aminoácido se lleva a cabo por la D- o L-aminoacilasa, que hidroliza sólo el enantiómero D- o L-, dependiendo de su estereoespecificidad. Mientras tanto, la NSAAR racemiza el enantiómero no hidrolizado por la L- o D-aminoacilasa, obteniendo así una conversión total y eliminando los pasos de racemización térmica y separación, que resultan bastante costosos.
En trabajos anteriores, nuestro grupo de investigación ha llevado a cabo la caracterización de la L-carbamilasa de Geobacillus stearothermophilus CECT43 (BsLcar) y de la N-succinil-aminoácido racemasa de Geobacillus kaustophilus CECT4264 (GkNSAAR), demostrando la alta promiscuidad de sustrato que presentan ambas enzimas. En estos estudios, GkNSAAR demostró ser capaz de racemizar ambos isómeros de N-acetil-, N-succinil- and N-carbamil-aminoácidos, sin embargo, no se estudió su actividad frente a N-formil-aminoácidos. Por su parte, BsLcar hidrolizaba enantioespecíficamente diferentes N-acetil-, N-formil- y N-carbamil-L-aminoácidos.
Basándonos en los estudios arriba mencionados, proponemos acoplar ambas enzimas con la finalidad de formar un catalizador capaz de producir L-aminoácidos ópticamente puros. Este sistema bienzimático debería convertir mezclas racémicas de distintos aminoácidos N-sustituídos en los correspondientes L-aminoácidos, naturales y no naturales, ópticamente puros mediante Resolución Cinética Dinámica. Dado que sólo el L-aminoácido N-sustituido puede ser reconocido por BsLcar (pues esta enzima es estereoespecífica), se garantiza la pureza enantiomérica del L-aminoácido obtenido. Al mismo tiempo que L-isómero de la mezcla racémica es hidrolizado por BsLcar, el D-isómero es racemizado por GkNSAAR de manera similar al ¿Proceso de la Acilasa¿.
Nuestros resultados confirman que este sistema (BsLcar/GkNSAAR) es capaz de producir distintos L-aminoácidos ópticamente puros (e.e >99.5%) a partir de mezclas racémicas de diferentes aminoácidos N-sustituidos, presentando una mayor actividad frente a los N-formil-aminoácidos, seguidos de los N-carbamil-aminoácidos y en último lugar los N-acetil-aminoácidos. El sistema permite producir aminoácidos tales como L-homofenilalanina, ácido-L-2-aminobutírico (L-ABA), L-norleucina y L-fenilglicina. Además soporta altas concentraciones de sustrato y de producto sin inhibirse, aspecto que resulta de interés en la industria.
Seguidamente se ha estudiado y optimizado la inmovilización del sistema para mejorar sus propiedades catalíticas en la producción de L-aminoácidos ópticamente puros como L-fenilglicina, L-homofenilalanina, L-ABA, L-norleucina y L-metionina. El biocatalizador inmovilizado ha demostrado ser eficaz para tal fin, sin presentar inhibición a altas concentraciones de sustrato o de producto. Además, el proceso de inmovilización ha mejorado las propiedades del biocatalizador, manteniendo una actividad del 75% después de 10 ciclos de reacción, además de producir un aumento en la actividad de BsLcar frente al N-formil-triptófano.
Por último, dado que sólo se han descrito tres NSAARs con actividad frente a N-formil-aminoácidos (las de Geobacillus kaustophilus CECT4264, Amycolatopsis sp. TS-1-60 y Streptomyces atratus Y-53), se han buscado, clonado y sobreexpresado NSAARs procedentes de distintos organismos: Bacillus cereus (BceNSAAR), Geobacillus stearothermophilus (GstNSAAR), Pectobacterium atrosepticum (PatNSAAR) y Deinococcus radiodurans (DraNSAAR), utilizando la secuencia de GkNSAAR como molde. Únicamente la enzima NSAAR de Bacillus stearothermophilus CECT49 (GstNSAAR) ha mostrado propiedades catalíticas ligeramente mejores que GkNSAAR. Por este motivo ésta ha sido la única enzima caracterizada en profundidad en este trabajo.
Sólo las enzimas de Deinococcus y Geobacillus (además de GkNSAAR) mostraron actividad racemasa frente a los N-formil-derivados, mostrando así que no es tan fácil como pensamos en un principio encontrar nuevas enzimas que puedan mejorar el Proceso de la Amidohidrolasa utilizando N-formil-aminoácidos como sustratos. También se ha demostrado que GsNSAAR une y racemiza los N-formil-D-aminoácidos de manera más eficiente que el isómero L-. Por otro lado, los estudios mutacionales han confirmado el importante papel que desempeñan los residuos K166, D191, E216, D241 y K265 en la racemización de los sustratos.
