Resumen de Geographic structure, plasticity, genetic variation and covariation of chemical defences in maritime pine
RESUMEN Las coníferas son uno de los grupos de arbustos y árboles de vida larga más antiguos de la Tierra, apareciendo en el periodo Carbonífero hace 300 millones de años aproximadamente. Debido a su gran tamaño y longevidad, las coníferas están sometidas a multitud de interacciones bióticas antagonistas ante las que deben defenderse. Esta coevolución con múltiples agentes bióticos durante decenas de miles años ha derivado en el desarrollo de mecanismos complejos de defensa por parte de las coníferas.
Las defensas físicas y las defensas químicas configuran las dos principales barreras de coníferas que repelen, detienen, impiden la entrada o eliminan al organismo invasor. Por un lado, las defensas físicas están mayormente presentes en la capa externa de los tejidos de coníferas, compuestas sobre todo por deposiciones de numerosas capas de lignina y suberina, y también cristales de oxalato que actúan como barreras multifuncionales para el ambiente exterior. En el interior, además, está presente el esclerénquima, un tejido mecánicamente resistente ubicado en el floema secundario que sirve como método de defensa físico. Por otro, las defensas químicas constituyen un amplio abanico de biomoléculas tóxicas e indigestas, proteínas y enzimas y también compuestos químicos almacenados, como los terpenos, fenoles y alcaloides que pueden repeler, dañar o incluso matar a los organismos invasores. Entre dichas defensas químicas, los terpenos y los fenoles constituyen los metabolitos secundarios (plant secondary metabolites, PSM) más importantes de coníferas, de los que se asume una actividad específica y efectividad contra insectos herbívoros y hongos patógenos.
Los terpenos, por un lado, son el componente mayoritario de la resina, en la que se diferencian dos fracciones: una fracción volátil o trementina, compuesta por monoterpenos y sesquiterpenos; y una fracción no volátil o colofonia, constituida por diterpenos y ácidos resínicos. Cuando se produce una herida, la resina fluye hacia la zona del daño y, tras evaporarse la fracción volátil, los ácidos resínicos cristalizan, sellan la herida y previenen la entrada de los enemigos, en ocasiones atrapándolos en el proceso. Los fenoles, por otro lado, comprenden una larga variedad de compuestos como los flavonoides, lignanos, estilbenos, ácidos hidroxicinámicos y taninos, entre otros. A diferencia de los terpenos, los fenoles se almacenan en la vacuola de las células polifenólicas del parénquima, y son liberadas cuando la célula se rompe debido al ataque de un enemigo.
Aparte de los distintos tipos de defensa, las coníferas presentan dos tipos de estrategias para combatir a sus enemigos de una manera eficiente. Por un lado, las defensas pueden ser ʻconstitutivasʼ cuando están presentes en ausencia de daño. Por otro, cuando estímulos de señalización de daño tienen lugar, se producen cambios cuantitativos y cualitativos en estructuras anatómicas y en el perfil químico de PSM, originando las denominadas defensas ʻinducidasʼ. El cambio registrado entre los niveles constitutivos e inducidos de PSM se conoce como ʻinducibilidadʼ, y representa un carácter funcional clave de la plasticidad fenotípica presente en plantas que está estrechamente relacionado con la resistencia biótica.
Los primeros estudios que hicieron hincapié en el papel defensivo de los PSM y la existencia de una coevolución entre plantas y herbívoros, en las décadas de los 1950 y 1960, sentaron un paradigma en el estudio de las interacciones recíprocas de planta-herbívoro. El valor adaptativo de los PSM como caracteres de resistencia se puso de manifiesto en la literatura desarrollada a lo largo de las décadas, encontrando, por ejemplo, cómo los PSM volátiles influyen en el comportamiento de los enemigos o de sus predadores, o como otros actúan directamente como compuestos tóxicos. Más recientemente, el papel de la inducibilidad de las defensas ha recibido una atención especial al tratarse de una de las principales fuentes de variación adaptativa en la inversión de defensas, siendo crucial para una resistencia efectiva contra enemigos concretos. Debido a los costes asociados a la producción de defensas, la inducibilidad surge como una estrategia de ahorro de recursos, destinándolos a aumentar la producción de defensas sólo cuando se produce daño. A pesar de las múltiples asociaciones positivas entre los PSM constitutivos –y su inducibilidad– con la resistencia a herbívoros específicos, estudios que han tratado de demostrar relaciones causales entre PSM individuales o conjunto de PSM con la resistencia obtuvieron resultados inconclusos, lo que ha puesto en tela de juicio el papel defensivo de los PSM en la actualidad.
Aparte de las respuestas intrínsecas de las plantas para defenderse (i.e. constitutivas e inducidas), múltiples factores influyen en cómo las plantas asignan sus recursos para las defensas. Así, la variabilidad fenotípica en caracteres de resistencia de plantas se puede atribuir a efectos de la ontogenia (juvenil vs. adulto), del ambiente abiótico, de la genética (individuo, familia, población o entre especies), de la fenología, del tipo y de la intensidad de la presión biótica y de la interacción entre todos ellos. La complejidad que entraña comprender la interrelación de estos factores en relación con las defensas ha llevado a la comunidad científica a proponer diversas teorías que expliquen los patrones de variación en las defensas de plantas y los costes fisiológicos asociados con otras funciones vitales, como el crecimiento y la reproducción.
El germen de esta Tesis Doctoral surgió por la necesidad de ahondar en los vacíos existentes en relación a los patrones variación en estrategias defensivas a lo largo de las poblaciones de pinos mediterráneos, compuestos por especies con una distribución altamente fragmentada, que abarcan desde los húmedos bosques atlánticos franceses en el norte, hasta las localizaciones más inhóspitas y aisladas del norte de África. La falta de información detallada sobre el potencial defensivo adaptativo en esas especies supone un importante hándicap para anticipar la gestión forestal a las perturbaciones derivadas del cambio climático. Entre ellas, un aumento de la incidencia de herbívoros y patógenos, agravadas por eventos cada vez más recurrentes de incendios y sequía, podrían suponer una seria amenaza para las masas naturales de pinos. Además, se espera que tales cambios afecten inicialmente a masas naturales de latitudes y altitudes más bajas y que, progresivamente, vayan afectando a poblaciones más norteñas. Comprender cómo las estrategias defensivas varían a lo largo de las poblaciones de las especies, y qué factores determinan dicha variación, contribuirá a anticipar las consecuencias adversas venideras fruto del cambio climático. Con este conocimiento al alcance, estrategias de conservación y gestión, selección de caracteres defensivos adaptativos que covaríen con otros caracteres productivos, y migración asistida de las poblaciones constituirán herramientas fundamentales para preservar la diversidad genética actual y poder disfrutar de un futuro en presencia de pinares mediterráneos singulares.
Para acometer estas ideas, se decidió utilizar el pino marítimo como especie modelo de conífera mediterránea por varias razones. Primero, esta especie ha sido ampliamente estudiada en numerosos caracteres relevantes de historia vital, como el crecimiento, la reproducción, defensas y resistencia a estreses bióticos y abióticos, mostrando una gran variación genética tanto entre como dentro de poblaciones. Adicionalmente, se observó que esta variación está geográficamente estructurada para varios de los caracteres, lo que sugiere procesos adaptativos en la diferenciación de estrategias vitales a lo largo de poblaciones de la especie. Debido a su peculiar ruta de recolonización postglaciar y su distribución fragmentada actual a lo largo del sur de Europa, se han identificado ocho clados genéticos utilizando marcadores moleculares, que describen una historia demográfica singular. Su distribución irregular a lo largo de la región mediterránea, caracterizada por sus condiciones ambientales altamente variables, hace que las poblaciones naturales de las regiones con mayor limitación de recursos sean las que probablemente se encuentren más amenazadas (como otras especies mediterráneas) por las consecuencias inminentes de los rápidos cambios asociados a la variación climática. En conjunto, todas estas particularidades convierten al pino marítimo en una especie apropiada como modelo de estudio, para abordar formalmente los vacíos actuales en la variación de estrategias defensivas, sus implicaciones ecológicas y evolutivas, y extender, en la medida de lo posible, los hallazgos de la presente tesis a las demás especies de coníferas.
Pese a que un buen número de estudios previos han explorado la variación en caracteres de historia vital tanto entre como dentro de poblaciones en esta especie, todavía se conoce poco sobre la variación genética existente entre poblaciones y familias dentro de poblaciones en PSM constitutivos y su inducibilidad, así como su asociación con la resistencia. Además, todavía queda por explorar cómo esta variación genética es dependiente del contexto ambiental en el que se forja, sobre todo en una especie tan fragmentada como el pino marítimo. Por lo tanto, explorar los patrones de variación ambiental en PSM inducibles y la resistencia dentro de esta especie contribuirá al entendimiento de las implicaciones ecológicas y evolutivas de las interacciones planta-enemigo, dentro del contexto de las más recientes y adaptadas teorías de defensas en plantas.
De esta manera, dado el estado del arte de las defensas de plantas, cómo éstas se relacionan presumiblemente con la resistencia, y las fuentes de variación fenotípica en pino marítimo, hipotetizamos que i) esta especie posee gran variación genética, tanto entre poblaciones como entre familias dentro de poblaciones en PSM constitutivos y su inducibilidad; ii) esta variación genética en PSM predice la variación genética asociada a la resistencia a la herbivoría; y iii) la variación genética en ambos caracteres, PSM y resistencia, muestra patrones clinales con el clima, tal y como predicen la teoría de defensas en plantas dentro de especies. Las tres hipótesis se corresponden con los tres capítulos que contiene el presente documento.
Para poder acometerlas, se utilizó un complejo diseño experimental desarrollado en invernadero que constituyó la piedra angular de esta tesis doctoral, con una evaluación fenotípica extensa y completa de caracteres defensivos de pinos jóvenes. Este experimento abordó la evaluación cuantitativa de la variación genética en un amplio compendio de PSM, y su papel asociado en la resistencia a la herbivoría, en el floema del tallo de una colección jerárquica de diez poblaciones y familias dentro de poblaciones en el rango de distribución natural de la especie. Además, dicha variación genética en PSM y resistencia se examinó en plantas control no inducidas (constitutivas) y en plantas previamente inducidas con una fitohormona señalizadora de daño, el metil jasmonato (MJ), que simula el daño producido por la herbivoría pero sin dañar los tejidos de la planta. Se sabe, sin embargo, que las medidas de inducción por MJ incluyen valores acumulados de la asignación previa constitutiva más la asociada a los cambios plásticos debidos a la inducción, lo que representa una fuente de sesgo en las evaluaciones del papel de PSM en la resistencia. Una profunda ventaja en el diseño experimental utilizado fue la inclusión de copias clonales de los genotipos dentro de cada familia, que se utilizaron para estimar con precisión la inducibilidad de los caracteres mediante la diferencia entre la copia clonal MJ-inducida menos la constitutiva del mismo genotipo. La inducibililidad de los PSM se estimó solamente en las copias clonales que no se sometieron al tratamiento de herbivoría para evitar el efecto de inducción por el insecto.
El análisis de PSM se llevó a cabo utilizando técnicas analíticas de precisión dependiendo del tipo de compuesto. Los terpenos se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) y, en el caso de los fenoles, mediante cromatografía de líquidos de ultrarresolución acoplada a espectrometría de masas y detección por fotodiodo (UHPLC-MS-DAD). En total, se identificaron y cuantificaron 118 PSM en el floema del tallo, agrupados en 8 conjuntos de compuestos por su naturaleza química. Por otro lado, la evaluación de la resistencia a la herbivoría se realizó mediante la estimación del área mordida por el insecto curculiónido Hylobius abietis L., un herbívoro comedor de floema que supone una plaga devastadora de los regenerados de coníferas, sobre todo en el norte de Europa. Además, se caracterizaron climáticamente los sitios de origen de las poblaciones para examinar los patrones de variación genética de los caracteres asociados al ambiente donde viven desde hace generaciones. Finalmente, debido a que los patrones de variación entre los caracteres evaluados y variables ambientales pueden estar influenciados por la historia demográfica de la especie, se genotiparon polimorfismos de un sólo nucleótido (single nucleotide polymorphism, SNP) a partir de copias clonales de los mismos individuos. Con esos SNP se construyeron matrices de estructura poblacional y de parentesco entre los individuos para poder tener idea de la influencia de la variación genética neutral asociada a la historia evolutiva de la especie. En conjunto, la novedad de este experimento radica en la caracterización de la variación genética en PSM constitutivos y la resistencia, así como su inducibilidad utilizando copias clonales, en una especie de conífera. Su singularidad también es destacable por examinar si los patrones de variación de los caracteres están asociados al ambiente, y corregir por el efecto de los múltiples niveles de parentesco para evitar relaciones espurias debidas a la variación neutral en la especie.
El primer capítulo de la Tesis se enfocó en la variación genética cuantitativa entre poblaciones y familias dentro de poblaciones en PSM constitutivos y en su inducibilidad. Se encontró una gran y geográficamente estructurada variación genética entre y dentro de poblaciones en la mayoría de PSM constitutivos, con marcadas diferencias en las fuerzas selectivas actuando sobre los distintos grupos de terpenos. Sin embargo, se detectó muy poca variación genética para la inducibilidad de los PSM. Por otro lado, los cambios observados en los patrones de variación de los grupos principales de PSM con el clima, tras corregir por la historia demográfica de la especie, indican claramente que la variación neutral asociada a procesos demográficos puede llegar a interferir completamente en la detección de patrones genéticos de variación adaptativa debidos al entorno abiótico.
En el segundo capítulo se exploró la asociación entre la variación genética en PSM y la variación genética entre y dentro de poblaciones en la resistencia a la herbivoría. Como se había encontrado también para los PSM, la variación genética en resistencia a la herbivoría mostró estar geográficamente estructurada entre poblaciones, con una mayor resistencia y una mayor reducción del daño tras la inducción por MJ en las poblaciones atlánticas que en las mediterráneas. El tratamiento de inducción por MJ ejerció un fuerte efecto en la reducción del daño por el insecto, muy superior a los efectos genéticos subyacentes de la población y la familia dentro de población. Al evaluar las asociaciones univariantes entre PSM y resistencia a nivel fenotípico explorando en conjunto los fenotipos control e inducidos, se encontraron multitud de relaciones negativas entre la concentración de PSM y el daño por el insecto. Sin embargo, apenas se encontraron relaciones significativas al evaluar el estado constitutivo y la inducibilidad por separado, lo que indica que el efecto del MJ observado previamente pudo haber forzado artificialmente las relaciones al explorar el conjunto de datos fenotípicos. Por otro lado, al evaluar cómo los PSM intervienen en la resistencia a la herbivoría a nivel multivariante, encontramos que un gran porcentaje de la variación en resistencia se explica por los PSM y que, particularmente, la inducibilidad del metaboloma defensivo tiene un papel crucial en la predicción del incremento de la resistencia frente a ataques bióticos.
El último capítulo de la tesis recopila la información obtenida de los dos capítulos previos para abordar un test de hipótesis de una de las teorías más actualizadas y reconocidas de las defensas en plantas, la Hipótesis de Disponibilidad de Recursos (Resource Availability Hypothesis, RAH). Esta hipótesis originalmente se formuló para explorar los patrones macroevolutivos de variación existentes entre especies. Sin embargo, debido al interés que suscitan sus predicciones, la RAH ha sido ocasionalmente testada para evaluar patrones de variación intraespecíficos. Dada la existencia de factores relevantes conceptualmente que ocasionan grandes diferencias entre comparaciones inter- e intraespecíficas, las predicciones de la RAH necesitaban una actualización y adaptación a nivel intraespecífico. Recientemente una revisión extensa de la literatura sobre la variación clinal en caracteres de defensa y resistencia, se propuso una adaptación del marco teórico para testar las predicciones de la RAH a nivel intraespecífico (RAHintra). En general, la literatura existente al respecto, todavía limitada, no resulta concluyente sobre la aplicabilidad de la RAH a nivel intraspecífico. Por ello, en este capítulo, aprovechamos la potencia de los datos experimentales de esta tesis para evaluar hasta qué punto la RAHintra es un buen marco conceptual para explicar la variación intraespecífica en las estrategias defensivas de una especie de vida larga como es el pino marítimo. Nuestros resultados soportan algunas de las predicciones de la teoría, pero no todas. Tal como predice la teoría, la variación climática entre los distintos orígenes del pino explica la diferenciación en crecimiento y en la inversión constitutiva en defensas pero las predicciones relacionadas con la variación en inducibilidad no se cumplen. La interpretación de los resultados pone de manifiesto la importancia de evaluar, en este tipo de estudios, múltiples ambientes comunes para explorar el efecto de la plasticidad a condiciones concretas, y cómo ésta influye en la inferencia de los patrones genéticos de variación entre poblaciones. El uso de un ambiente común sin aparente restricción de recursos probablemente dificultó la detección de compromisos genéticos entre caracteres (por ejemplo, defensas constitutivas vs inducibilidad), favoreciendo incluso la aparición de patrones positivos entre algunos de ellos (crecimiento vs resistencia). En otros estudios se ha observado que una baja disponibilidad de recursos propicia la emergencia de relaciones negativas entre caracteres, algo que sería necesario explorar en futuros estudios. Finalmente, y al igual que en capítulos previos, los resultados de este capítulo indican que la variación neutral asociada a la historia demográfica de la especie puede influir en gran medida en la detección de patrones genéticos de variación, influyendo, por tanto, en las interpretaciones finales sobre la variación clinal observada para la especie.
En la presente Tesis Doctoral se han abordado muchos de los aspectos que están relacionados con lo que constituye una caja negra en relación con la capacidad adaptativa defensiva de los pinares mediterráneos. Para ello se estudió en detalle la variación genética entre y dentro de poblaciones en defensas químicas y resistencia, y cómo se relacionan ésta con otros caracteres de historia vital y el ambiente abiótico de las poblaciones de origen. Los hallazgos descritos en este documento permitirán anticiparse a las consecuencias de un rápido cambio climático y global, mediante la implementación de medidas aplicadas. Por ejemplo, la identificación de materiales genéticos con mayor capacidad defensiva constitutiva representa un importante reservorio genético a tener en cuenta en programas de conservación y que podría ser usado como fuente potencial de caracteres de resistencia para hacer frente a la esperada mayor incidencia de plagas en el futuro. En este sentido, los resultados de esta tesis no permitieron identificar marcadores biológicos simples asociados a los patrones de variación en resistencia. La resistencia a un herbívoro concreto parece estar relacionada con aspectos multivariantes del conjunto de metabolitos más que con compuestos específicos. Este resultado es consistente con la existencia de múltiples enemigos que ejercen probablemente una selección difusa sobre los mecanismos defensivos del pino. La ampliación de la aproximación utilizada aquí a otros herbívoros (e.g. defoliadores, chupadores, etc) y organismos patógenos (hongos, nematodos, etc), analizando en particular el nivel de integración (correlaciones genéticas) de la resistencia a distintos enemigos, será crucial para completar una visión global de la capacidad adaptativa de esta especie frente al cambio global. Por otro lado, aunque los resultados de esta tesis no indican compromisos relevantes entre las estrategias defensivas y otros caracteres de historia vital (e.g. crecimiento), es necesario ser prudentes y verificar con nuevos estudios utilizando más ambientes y un mayor número de organismos nocivos la ausencia de compromisos que podrían interferir negativamente con otros caracteres de historia vital relacionados con la adaptación y aclimatación al cambio global.
SUMMARY Due to their longevity and large size, conifer species are exposed to a myriad of antagonistic biotic drivers. To cope with their enemies, conifers have developed complex mechanisms of defence. Among them, constitutive and induced chemical defences constitute the most important plant secondary metabolites (PSM) with defensive role, where terpene and phenolic compounds are relevant PSM commonly associated to resistance in conifers. Many factors are involved in the huge phenotypic variation in the allocation to PSM in conifers, such as genetics, the abiotic and biotic environment. Understanding how the interaction of such diverse and variable factors may determine the patterns of variation in PSM is highly complicated. Several researchers have developed successful predictive hypotheses to unravel how the biotic and abiotic environment shape the allocation to PSM across species, and, recently, across populations within species. In this sense, Mediterranean pine forests, with highly fragmented species, are particularly threatened by the expected increase in pest and pathogen incidence, derived from climate change. These issues might be exacerbated by more recurrent drought and fire events.
In this doctoral thesis, maritime pine, a model Mediterranean conifer, was used to address the current gaps in the variation of defensive strategies, and their ecological and evolutionary implications. The central experiment entailed the quantitative evaluation of the genetic variation in constitutive and the inducibility of a comprehensive array of PSM in the stem phloem, and their associated resistance to herbivory by the pine weevil, a bark chewer insect, in a hierarchical collection of ten populations, and families within populations, from the main distribution range of the species. The extensive phenotypic evaluation in this experiment derived in three chapters within this document. The first chapter focus on the quantitative genetic variation among populations and families within populations in constitutive PSM and in their inducibility. The second chapter aims to explore the genetic variation in resistance to herbivory among populations and families within populations, using Hylobius abietis as a model herbivore. In addition, this second chapter also explore to what extent PSM may predict resistance against herbivory at the genotypic level in maritime pine. The third chapter compiled the information from the previous chapters and focused on the hypothesis-testing of one of the most successful plant defence theories, the Resource Availability Hypothesis (RAH), adapted to the intraspecific level.
The large and geographically structured genetic variation among populations and among families within populations found in most constitutive PSM contrasts with the scarce genetic variation among and within populations in the inducibility of PSM. Similarly, large and geographically structured genetic variation was found for resistance to herbivory only among but not within populations, with greater resistance on the Atlantic populations compared to the Mediterranean ones. Interestingly, multivariate analyses of PSM provided more realistic information about the potential causal relationships between PSM and resistance to herbivory than evaluating single pairwise relationships or using broad groups of compounds. On the other hand, many of our findings supported some of the predictions of the RAHintra, but we did not find enough support for all them. This is probably because genetic-based patterns of variation of traits were also influenced by the plastic responses to the common garden conditions where populations were planted. In addition, we recommend to account for the neutral demographic processes of the evolutionary history of the species to avoid the emergence of spurious patterns of variation across resource gradients, and to properly identify adaptive environmental variation in a given trait. In future studies, exploring variation of defensive traits, and covariation with other traits of interest, across populations in multiple environments within tree species will provide potentially valuable information for breeding programs to fight against the consequences of climate change.
