Emission of greenhouse gases and microbial biodiversity in soils of agricultural interest. Effect of nitrogen fertilisation
- Autores: Antonio Castellano Hinojosa
- Directores de la Tesis: Jesús González-López (dir. tes.), Eulogio J. Bedmar (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2019
- Idioma: inglés
- ISBN: 9788413062129
- Número de páginas: 435
- Tribunal Calificador de la Tesis: Mª Belen Rodelas Gonzalez (presid.), Elisabet Aranda Ballesteros (secret.), Sergio Menéndez Villanueva (voc.), Miguel Quemada (voc.), Laura Cárdenas (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Fundamental y de Sistemas por la Universidad de Granada
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
- español
RESUMEN En los suelos agrícolas, la aplicación de fertilizantes inorgánicos nitrogenados conduce a la interacción de múltiples factores y procesos que están asociados principalmente con cambios en las propiedades fisicoquímicas del suelo, la emisión de gases de efecto invernadero y la ecología microbiana. Aunque el nitrógeno (N) es un nutriente esencial para el crecimiento de las plantas, el aumento de la fertilización nitrogenada ha alterado el ciclo natural de N en la biosfera, lo que resulta en diversos impactos ambientales, ecológicos y sobre la salud humana. Entre ellos, el aumento de la emisión de gases de efecto invernadero, de la lluvia ácida y eutrofización.
Después de la aplicación de un fertilizante nitrogenado al suelo, los procesos microbianos de nitrificación y desnitrificación son los principales responsables de las reacciones que conducen a la conversión de amonio (NH4+) y nitrato (NO3-), respectivamente, a la liberación a la atmósfera del gas de efecto invernadero óxido nitroso (N2O). Combatir los impactos negativos del aumento de los flujos de N2O plantea desafíos considerables y será ineficaz sin incorporar los procesos microbianos que intervienen en la emisión de N2O en las estrategias de mitigación. Aunque previos estudios han mostrado la existencia de relaciones individuales entre la fertilización con N y cambios en las propiedades bióticas y abióticas del suelo, un estudio integrado relacionando la forma del fertilizante N con diferencias en la emisión de N2O, cambios en las propiedades fisicoquímicas del suelo, alteraciones en la abundancia de los genes involucrados en la producción y reducción de N2O y los efectos sobre la diversidad bacteriana no se ha realizado.
Para responder a estas preguntas se eligieron los fertilizantes nitrogenados urea ([CO (NH2)2] amonio (NH4)2SO4 y nitrato (KNO3) para enmendar un suelo agrícola de textura franco-arenosa de tipo Cambisol procedente de Vega de Motril (Granada, España). Tomate (Solanum lycopersicum) y judía (Phaseolus vulgaris) se utilizaron como plantas representativas de la agricultura de la zona. Los suelos, cultivados o no, se mantuvieron en condiciones de invernadero y se fertilizaron con 260 kg N ha-1. Como control se empleó suelo no fertilizado. Los suelos no cultivados se mantuvieron durante 3 años y los cultivados durante 4 cosechas consecutivas de, aproximadamente, 4 meses cada una. Durante ese tiempo, los suelos se regaron una vez a la semana para alcanzar un 80% de WFPS (Water Filled Pore Space). La concentración de los fertilizantes se determinó regularmente y cuando fue necesario, el suelo se complementó con el fertilizante correspondiente para alcanzar la tasa inicial de fertilización nitrogenada. Las variables abióticas del suelo pH, NH4+, NO3-, carbono total (TC), nitrógeno total (TN) y carbono orgánico total (TOC) se determinaron mediante muestreos puntuales durante la incubación. La producción de N2O se determinó regularmente empleando cromatografía de gases. Se tomaron muestras de suelo para determinar la abundancia total de a) bacterias (16SB) y arqueas (16SA), b) bacterias (AOB) y arqueas (AOA) oxidantes de amonio, y c) genes de la desnitrificación. La estimación de la abundancia de los genes 16S rRNA, amoA AOA, amoA AOB, napA, narG, nirK, nirS, norB, nosZI y nosZII se llevó a cabo mediante PCR cuantitativa (qPCR). Las variaciones en la abundancia relativa de OTUs (Operational Taxonomic Units) se determinó mediante pirosecuenciación del gen 16S rRNA.
Para analizar el efecto de la fertilización con N y la profundidad del suelo se adicionó urea, amonio y nitrato al suelo. La producción de N2O y la abundancia de genes del ciclo del N se determinaron a lo largo de la capa cultivable (20 cm) del suelo. Las variaciones en las emisiones de N2O a lo largo del perfil dependieron del tipo de fertilizante y del contenido de oxígeno disuelto detectado a cada profundidad. Las emisiones de N2O se correlacionaron con la abundancia de las comunidades nitrificantes y desnitrificantes en el suelo. Si bien la producción de N2O por nitrificación fue dominante en el horizonte del suelo de 0 a 10 cm, la desnitrificación fue el principal impulsor de la producción de N2O en la profundidad de 10 a 20 cm. El gen nosZ fue el más sensible al contenido de oxígeno disuelto a lo largo del perfil del suelo.
Para determinar el efecto de la fertilización nitrogenada sobre a) las características fisicoquímicas del suelo, b) la emisión de N2O, c) los cambios en la abundancia de las comunidades bacterianas y arqueas, d) la abundancia de las comunidades nitrificantes y desnitrificantes y e) las variaciones en la diversidad bacteriana, se aplicó al suelo urea, amonio o nitrato y se cultivó, o no, con tomate y judía. El estudio incluyó tanto el suelo no rizosférico como el rizosférico de las plantas. Los flujos de emisión de N2O mostraron un pico máximo aproximadamente 2 semanas después de la fertilización con N, tanto en suelos cultivados como no cultivados. La emisión acumulada de N2O fue mayor en los suelos cultivados que en los no cultivados, y más elevada en el suelo cultivado con judía. Independientemente de la presencia o ausencia de las plantas, la emisión acumulada de N2O en el suelo tratado con urea fue mayor que el suelo con amonio y, a su vez, este mayor que el fertilizado con nitrato. Las diferencias en las emisiones de N2O se asociaron a un distinto porcentaje de los genes involucrados en la producción y reducción de N2O. Se requiere, de forma simultánea, la aplicación de un fertilizante nitrogenado y condiciones de elevada humedad para la máxima producción de N2O. Las disminuciones en la producción de N2O durante 3 años de incubación para suelos sin cultivar y 4 cosechas consecutivas para suelos cultivados se asociaron con aumentos en la abundancia del gen nosZ. La fertilización con N disminuyó la abundancia de bacterias y arqueas totales en suelos no cultivados y aumentó en los suelos cultivados. Estos resultados se asociaron al contenido de carbono del suelo.
El gen amoA AOA fue más abundante que el gen amoA AOB en el suelo de la rizosfera y, por el contrario, la abundancia del amoA AOA fue menor que la del amoA AOB en el suelo no rizosférico. Los genes de la desnitrificación fueron más abundantes en el suelo no rizosférico. La fertilización con N disminuyó el número y la abundancia relativa de las OTUs bacterianas en los suelos cultivados o no con plantas de tomate y judía; este efecto fue más severo en el suelo rizosférico. La disponibilidad de N determinó principalmente los cambios en la estructura de la comunidad bacteriana en el suelo no rizosférico y fue más intenso en el suelo rizosférico. Después de la fertilización, la comunidad bacteriana fue menos diversa o dominada por un menor grupo de OTUs. En los 3 suelos fertilizados, tanto las OTU dominantes y minoritarias disminuyeron en el suelo rizosférico, mientras que solo las OTU minoritarias disminuyeron en el suelo no rizosférico.
Para explorar la contribución relativa de la nitrificación y la desnitrificación en la producción de N2O después de una fertilización de 3 años con amonio o nitrato, se utilizó la técnica del marcado con 15N. En el suelo tratado con amonio, el N2O se originó a partir de la nitrificación casi por igual que de la desnitrificación mientras que la emisión del suelo tratado con nitrato derivó principalmente de la desnitrificación. La mayor abundancia del gen nosZI en el suelo tratado con nitrato fue consistente con el mayor enriquecimiento de 15N2.
Para construir un modelo que explicara la importancia relativa de cada una de las variables bióticas y abióticas analizadas y la biodiversidad bacteriana como determinantes de la emisión de N2O, se realizó un análisis combinado de modelos de ecuaciones estructurales y de “bosques aleatorios” utilizando el conjunto de datos derivado de este estudio. Los resultados mostraron que las emisiones de N2O estuvieron controladas principalmente por las variables bióticas (abundancia de los genes amoA AOA. amoA AOB, napA, nirK, norB, nosZI y un conjunto de 16 OTUs bacterianas) más que por las variables abióticas (contenido de NH4+ y NO3-).
Para cuantificar la importancia de la desnitrificación bacteriana y fúngica después de la aplicación de nitrato, se utilizó la aplicación individual y combinada de inhibidores del crecimiento bacteriano (estreptomicina) y fúngico (cicloheximida). Aunque las bacterias y los hongos contribuyeron casi por igual a la producción de N2O en el suelo, las bacterias dominaron sobre las de los hongos durante los primeros 2-3 días posteriores a la aplicación de nitrato. Después de ese tiempo, la situación se revirtió y la producción de N2O por hongos llegó a dominar la de las bacterias.
La investigación de los efectos de la aplicación simple y combinada del inhibidor de la ureasa N-(n-butil) triamida tiofosfórica (NBPT) y del inhibidor de la nitrificación 3,4 dimetilpirazol fosfato (DMPP) sobre la volatilización de amoniaco (NH3) y la abundancia de las comunidades nitrificantes y desnitrificantes también se abordó en este estudio. La aplicación de NBPT redujo la volatilización de NH3 y no afectó la abundancia de bacterias y arqueas totales, ni la de los genes de la nitrificación, pero redujo la abundancia de genes de la desnitrificación al 80% de WFPS. El DMPP, solo y en combinación con NBPT, aumentó la volatilización del NH3 y la abundancia de bacterias y arqueas totales así como de la comunidad nitrificante en el suelo. Independientemente de las condiciones de humedad, DMPP y, en menor medida, DMPP + NBPT, aumentaron el número de copias los genes norB y nosZ, lo que indica que DMPP, de alguna manera, induce la expresión de, al menos, estos dos genes de la desnitrificación.
- English
SUMMARY In agricultural soils, the application of inorganic nitrogen (N) fertilisers leads to the interaction of multiple factors and processes which are mainly associated with changes in soil physicochemical properties, emission of greenhouse gases and microbial ecology. Although N is an essential nutrient for plant growth, increased application of N-fertilisers in agriculture has altered the natural N cycle, which result in many environmental, ecological and human health impacts. Among them, N-fertilisation may lead to an increase in the emission of greenhouse gases, acidic deposition and eutrophication.
After application of an N-fertiliser, the microbial processes of nitrification and denitrification are the main responsible of the reactions driving the conversion of ammonia (NH4+) and nitrate (NO3-) to the release of the greenhouse gas nitrous oxide (N2O) into the atmosphere, respectively. Combating the negative impacts of increasing N2O fluxes poses considerable challenges and will be ineffective without incorporating microbial regulated N2O processes into mitigation strategies. Although previous studies had shown individual relationships between N-fertilisation and soil biotic and abiotic parameters, an integrated study relating the form of the N fertiliser with differences in N2O emission, changes in soil physicochemical properties, alterations in the abundance of the genes involved in N2O production and reduction, and effects on bacterial diversity had not been reported.
To address these questions, the N-fertilisers urea ([CO(NH2)2] ammonia (NH4)2SO4 and nitrate (KNO3) were chosen to amend an agricultural Cambisol soil from Vega de Motril (Granada, Spain). Tomato (Solanum lycopersicum) and common bean (Phaseolus vulgaris) were used as representative vegetable plants. Soils, cultivated or not, were kept under greenhouse conditions and fertilised at an N rate of 260 kg N ha-1. Unfertilised soil was used as a control. Uncultivated soils were incubated for 3 years and cultivated soils for 4 consecutive harvests of about 4 months each. During that time, the soils were watered once a week to reach 80% water filled pore space (WFPS). The concentration of the fertilisers was determined regularly and when required the soil was supplemented with the corresponding N-fertiliser to reach the initial N-fertilisation rate. Soil abiotic variables pH, NH4+, NO3-, total carbon (TC), total N (TN) and total organic carbon (TOC) were determined by spot sampling during incubation. The production of N2O was regularly determined by gas chromatography. Soil samples were taken to determine the total abundance of a) soil bacteria (16SB) and archaea (16SA) by quantitative PCR (qPCR) of the 16S rRNA gene, respectively; b) ammonia oxidising (AO) bacteria (AOB) and archaea (AOA) by qPCR of the corresponding amoA gene, respectively, and c) denitrification genes by qPCR of the napA, narG, nirK, nirS, norB, nosZI and nosZII genes. Variations in the relative abundance of the bacterial OTUs were determined after pyrosequencing of the 16S rRNA gene.
To analyse the distinct effect of N-fertilisation and soil depth, urea, ammonium and nitrate were applied to the soil. N2O production and the abundance of N-cycling genes were determined along the 20-cm layer of the arable topsoil. Variations in N2O emissions along the soil profile were dependent on the type of N-fertiliser and the soil depth-related dissolved oxygen content. Also, N-gas emissions correlated with the abundance of the nitrifying and denitrifying communities in the soil. While N2O production by nitrification was dominant in the 0- to 10-cm soil horizon, denitrification was the main driver of N-gas production in the 10- to 20-cm depth. The nosZ gene was the most sensitive to soil depth-related dissolved oxygen content.
To determine the effect of N-fertilisation on the a) soil physicochemical characteristics, b) N2O emission, c) changes in the abundance of the bacterial and archaeal communities, d) abundance of the nitrifying and denitrifying guilds and e) variations in bacterial diversity, urea, ammonium and nitrate were applied to the soil cultivated or not with tomato and common bean. The study included the bulk and rhizosphere soil of the plants. Fluxes of N2O emission showed a peak about 2 weeks after N-fertilisation both in cultivated and uncultivated soils. The cumulative N2O emission was higher in cultivated than uncultivated soils, and higher in the soil cultivated with common bean. Regardless of the presence or the absence of the plants, on a yearly basis, urea produced the higher cumulative emission followed by ammonium and, finally, nitrate. Differences in N2O emissions were associated to a distinct ratio of the genes involved in the production and reduction of N2O. Simultaneous application of high water moisture content and inorganic N-fertiliser was required for maximum N2O production.
Decreases in N2O production during 3-year incubation for uncultivated soils and 4 consecutive harvests for cultivated soils were associated to increases in the nosZ gene abundance.
N-fertilisation decreased the abundance of the total bacterial and archaeal communities in uncultivated soils and increased their abundance in the cultivated soils. These results were associated to the soil carbon content.
The amoA AOA was more abundant than the amoA AOB gene in the rhizosphere soil and, on the contrary, the abundance of the amoA AOA was lower than that of the amoA AOB in the bulk soil. The denitrification genes were more abundant in the bulk soil. N-fertilisation decreased the number and the relative abundance of bacterial OTUs in soils cultivated or not with tomato and common bean plants; this effect was more severe in the rhizosphere soil. N availability mainly determined the changes in the structure of the bacterial community in bulk and even more in the rhizosphere soil, and the bacterial community became less diverse or dominated by a small group of OTUs. After N-fertilisation, dominant and rare OTUs decreased in the rhizosphere while only the rare OTUs vary in the bulk soil.
To explore the relative contribution of nitrification and denitrification to N2O production after 3-year fertilisation with ammonium or nitrate, the 15N tracer technique was used. In the ammonium-treated soil, N2O originated from nitrification almost equally that from denitrification and emission from the nitrate-treated soil derived mostly from denitrification. The higher abundance of the nosZI gene in the soil treated with nitrate was consistent with the highest 15N2 enrichment.
To build a model to understand the relative importance of each analysed biotic and abiotic variables and bacterial biodiversity as drivers of N2O emission, combined random forest (RF) and structural equation modelling (SEM) analyses were run using the dataset derived from this study. The results show that N2O emissions were mainly controlled by the biotic (amoA AOA. amoA AOB, napA, nirK, norB, nosZI genes and a set of 16 bacterial OTUs) than the abiotic (NH4+ and NO3- contents) variables.
To quantify the importance of bacterial and fungal denitrification post nitrate application, single and combined application of bacterial (streptomycin) and fungal (cycloheximide) growth inhibitors were used. Although bacteria and fungi almost equally contributed to soil N2O production, bacteria dominated over that of fungi during the first 2-3 days post nitrate application. After that time, the situation reversed and the production of N2O by fungi came to dominate that of bacteria.
Investigation of the effects of the single and combined application of the urease inhibitor N-(n-butyl) thiophosphoric triamide (NBPT) and the nitrification inhibitor 3,4 dimethylpyrazole phosphate (DMPP) on ammonia (NH3) volatilisation and the abundance of the nitrifier and denitrifier communities have also pursued in this study. The application of the urease inhibitor NBPT reduced NH3 volatilisation and did not affect the bacterial and archaeal abundance, nor that of the nitrifiers, but reduced the abundance of denitrifiers at 80% WFPS. DMPP, alone and in combination with NBPT, increases NH3 volatilisation and the abundance of bacteria, archaea and nitrifiers in the soil. Regardless of the moisture conditions, DMPP and to a lower extent DMPP + NBPT, increases the gene copy number of the norB- and nosZ-bearing denitrifying communities, which indicates that DMPP, somehow, induces the expression of the, at least, the norB and nosZ denitrification genes.
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