Characterization of Vaccinia virus alternative antigen transport and processing pathways for their presentation to cytotoxic CD8+ T lymphocytes

• Autores: David Gamarra Carrasco
• Directores de la Tesis: Margarita del Val Latorre (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 124
• Tribunal Calificador de la Tesis: José María Almendral del Río (presid.), Luis Antón Canto (secret.), Salvador Iborra Martín (voc.), Manuel Ramos Álvarez-Buylla (voc.), José Ramón Regueiro González-Barros (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Inmunología
      • Antígenos
    • Virología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • español

    Los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) exploran la superficie de las células del organismo en busca de anomalías, lo que permite su correcta eliminación. Para que esto sea posible, las células del organismo procesan proteínas tanto endógenas como derivadas de patógenos, generando péptidos que se cargan y presentan en moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC-I). La presentación de antígenos por la vía clásica involucra al transportador asociado a presentación antigénica (TAP). Este transportador permite a los antígenos peptídicos acceder al retículo endoplasmático, donde se asocian los complejos MHC-I. Sin embargo, se han descrito diferentes epítopos que se presentan de forma independiente de este transportador.

    Nos propusimos caracterizar la o las proteasas implicadas en la presentación independiente de TAP. Utilizando linfocitos T CD8+ purificados de bazos de ratones C57BL/6 infectados con el virus vaccinia y células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC), estudiamos la importancia del proteasoma en la presentación de antígenos independientes de TAP. Midiendo la activación mediante la técnica de tinción intracelular de citoquinas (ICS) de los linfocitos T CD8+ purificados estimamos que tras el tratamiento con el inhibidor del proteasoma lactacistina (LC) a BMDC de ratones C57BL/6 y TAP1-/-, la inhibición de la presentación de antígeno es fuerte y similar en ambos casos. Por tanto, al igual que en las BMDC silvestres, el proteasoma juega un papel principal en la presentación de antígenos en BMDC deficientes en TAP.

    Con el objetivo de caracterizar proteasas alternativas involucradas en el procesamiento de antígenos virales estudiamos, para una batería de ocho epítopos, la activación de CTL monoespecíficos tras estimularlos con BMDC infectadas y tratadas con inhibidores de diferentes proteasas. Sólo observamos un efecto sobre la presentación antigénica tras el tratamiento con el inhibidor de pro-protein convertasas dec-RVKR-cmk, que inhibió en gran medida la presentación de uno de los ocho epítopos.

    Una vez conocida la existencia de mecanismos alternativos de presentación en MHC-I, quisimos saber si estos tenían relevancia fisiológica en una infección por el virus vaccinia. Para ello, inoculamos tanto ratones silvestres como TAP1-/- con BMDC cargadas con péptidos sintéticos. Tras catorce días, infectamos los ratones con virus vaccinia y medimos la carga viral a diferentes días post-infección y en diferentes órganos. En bazo, observamos un efecto protector de los tres péptidos tanto en los ratones silvestres como en los ratones TAP1-/-. Estos resultados sugieren que distintos tipos celulares podrían tener activas distintas vías alternativas de procesamiento antigénico, siendo más relevantes en unos órganos que en otros. También, confirman la existencia de las vías independientes de TAP descritas previamente en el laboratorio para los epítopos estudiados.

  • English

    CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) screen the surface of the cells in the organism in seek of abnormalities, which allows their correct elimination. This is possible because the cells in the organism process proteins, either self-proteins or pathogen-derived. This degradation generates peptides that are loaded and presented on class I major histocompatibility complexes molecules (MHC-I). The presentation of antigens through the classical pathway involves the transporter associated to antigen processing (TAP). This transporter allows peptidic antigens access the endoplasmic reticulum, where they are loaded onto MHC-I complexes. However, different epitopes that are presented in a TAP-independent manner have been described.

    We aimed to characterize the protease or proteases involved in the TAP-independent antigen presentation. Using CD8+ T lymphocytes purified from spleens from VACV-infected C57BL/6 mice and dendritic cells derived from bone marrow (BMDC), we studied the importance of the proteasome in TAP-independent VACV antigen presentation. Measuring CD8+ T lymphocyte activation by intracellular cytokine staining (ICS), we estimated that, after treatment of C57BL/6 and TAP1-/- VACV-infected BMDC with the proteasome inhibitor lactacystin (LC), the inhibition of the antigen presentation is strong and similar in both cases. Therefore, just like in wild type BMDC, proteasomes play a key role in TAP-independent VACV antigen presentation in BMDC.

    With the aim of characterizing alternative proteases involved in the antigen processing we studied, for eight peptides, the activation of monospecific CTL after VACV-infected BMDC stimulation. These BMDC were also treated with inhibitors of different proteases. We only observed an effect on antigen presentation after the treatment with the pro-protein convertases inhibitor dec-RVKR-cmk, which inhibited the presentation of one epitope.

    Once we acknowledged the existence of alternative MHC-I antigen presentation mechanisms, we wanted to know whether these had any physiological relevance on a VACV infection. For that, we inoculated C57BL/6 as well as TAP1-/- mice with synthetic peptide-loaded BMDC. After fourteen days, we infected the mice with VACV and measured the viral load at different days post-infection and in different organs. In spleens we observed a protective effect by the three peptides included in the study in C57BL/6 as well as in TAP1-/- mice. These results suggest that different cell types may have different alternative antigen processing pathways activated, being more relevant in some organs than in others. Also, they confirm the existence of previously described VACV antigen processing TAP-independent route