Regulation of DNA replication by chromatin structure in mammalian cells

• Autores: Ricardo Manuel Almeida
• Directores de la Tesis: María Gómez Vicentefranqueira (dir. tes.), Luis Blanco Dávila (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 149
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ferran Azorín Marín (presid.), José Antonio Tercero Orduña (secret.), Juan Méndez Zunzunegui (voc.), Félix Prado Velasco (voc.), Alessandra Agresti (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • español

    Resumen Siempre que una célula se divide, su información genética debe ser duplicada con precisión. Esta característica une de manera universal a todos los organismos vivos desde la bacteria más sencilla hasta el eucariota más complejo, demostrando su papel fundamental como uno de los pilares básicos de la vida. Desde el descubrimiento de la estructura del ADN se ha aprendido mucho sobre cómo se replican distintos genomas, en especial, sobre la maquinaria básica implicada en este proceso. En células eucariotas la replicación del ADN tiene lugar durante la fase S del ciclo celular, gracias a la actividad de cientos de miles de orígenes de replicación (ORIs) distribuidos a lo largo de sus genomas, en un contexto de estructura de la cromatina altamente compactado. A pesar de que el mecanismo molecular de activación de los ORIs está altamente conservado en eucariotas, los ORIs no muestran especificidad de secuencia en genomas complejos. Sin embargo, no se encuentran distribuidos al azar y, además, numerosas evidencias sugieren que la accesibilidad del ADN puede ser un importante determinante de la especificación de los ORIs.

    El objetivo de este trabajo ha sido comprobar la hipótesis de que, en células de mamífero, la conformación de la cromatina regula tanto la especificación de los ORIs como su actividad. Para probar nuestra hipótesis, hemos realizado en primer lugar un análisis de alta resolución de los sitios de inicio de síntesis de ADN y de arquitectura nucleosomal en ORIs eficientes. Hemos comprobado que estos ORIs son altamente variables tanto en su conformación nucleosómica como en los patrones de iniciación de la replicación del DNA y, además, que los perfiles de iniciación de replicación reflejan la organización nucleosómica. A continuación, hemos realizado un análisis funcional del impacto de las alteraciones en la configuración de la cromatina sobre la definición de los ORIs y la cinética de la elongación de la replicación. Hemos descubierto que la pérdida de compactación de la cromatina que ocurre en células deplecionadas en la histona H1 desestabiliza los patrones de iniciación de la replicación, originando la acumulación de horquillas bloqueadas y de daño en el ADN, como consecuencia de conflictos entre la replicación y la transcripción. Por otra parte, la disminución en la ocupación nucleosómica debida a la falta de la proteína HMGB1 tiene como consecuencia un incremento en la velocidad de las horquillas de replicación, sin impacto en su estabilidad y sin alterar los patrones de iniciación de la replicación. Por tanto, hemos encontrado que perturbaciones en la integridad de la cromatina generan un abanico de respuestas en la dinámica tanto de la replicación del ADN como de la transcripción, con distintas consecuencias en estrés replicativo. Estos descubrimientos tienen importantes implicaciones en situaciones fisiológicas o patológicas en las que se producen defectos en la estructura de la cromatina, como ocurre durante el envejecimiento celular o en algunas enfermedades de desarrollo o en el cáncer, en las que se genera inestabilidad genómica.

  • English

    Abstract Every time a cell divides the genetic information contained within must be accurately duplicated. This is a feature that universally connects every living organism from the simplest bacteria to the most complex eukaryote, showing its fundamental importance as one of the basic pillars of life on our planet. Since the discovery of the molecular structure of the DNA much has been learned in regards to how different genomes duplicate, especially in what concerns the basic machinery that is involved in this process. In eukaryotic cells, DNA replication occurs during the S-phase of the cell cycle through the activity of hundreds to thousands of replication origins (ORIs) distributed along their large genomes, in a context of a tightly packaged chromatin structure. Even though the molecular mechanism by which ORIs are activated is highly conserved, ORIs do not seem to display any DNA sequence specificity in complex genomes. Nonetheless, they are not randomly distributed, and growing evidence suggests that DNA accessibility could be a major determinant of ORI specification. The objective of this work was testing the hypothesis that, in mammalian cells, chromatin conformation regulates both the location of the ORIs as well as their activity. To test this hypothesis we first conducted a high-resolution analysis of DNA synthesis start sites and nucleosome architecture at efficient mammalian ORIs. We found that mammalian origins are highly variable in nucleosome conformation and initiation patterns, and that replication initiation profiles mirror nucleosome organization. Second, we performed a functional analysis of the impact of altered chromatin configurations in the definition of the ORIs and in the kinetics of replication elongation. We found that loss of chromatin compaction in H1-depleted cells massively disrupts the replication initiation patterns, triggering the accumulation of stalled forks and DNA damage as a consequence of transcription-replication conflicts. On the contrary, reductions in nucleosome occupancy due to the lack of HMGB1 cause faster fork progression without impacting the initiation landscape or fork stability. Thus, perturbations in the integrity of the chromatin template elicit a range of responses in the dynamics of DNA replication and transcription, with different consequences on replicative stress. These findings have broad implications for our understanding of how defects in chromatin structure, such as those occurring during cellular aging or in some developmental disorders and cancer, contribute to genomic instability.