Modeling splicing-related retinitis pigmentosa in caenorhabditis elegans
- Autores: Karinna Denise Rubio Peña
- Directores de la Tesis: Julian Ceron Madrigal (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Pompeu Fabra ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Miguel Carballo Villarino (presid.), Juan Cabello Pardos (secret.), Rafael Pascual Vázquez Manrique (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad Pompeu Fabra
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
Retinosis pigmentaria (comúnmente conocida como retinitis pigmentosa por su nombre en inglés-RP) es una enfermedad rara caracterizada por la pérdida progresiva de los fotoreceptores de la retina. Afecta aproximadamente 1 en 3500 individuos alrededor del mundo siendo la forma más común de degeneración de la retina hereditaria. Un subtipo de la forma autosómica dominante de RP (adRP) ha sido recientemente asociado con mutaciones en factores del splicing que pertenecen al complejo U4/U6•U5 tri-snRNP el cual está involucrado principalmente en el ensamblaje, y algunos de sus componentes en la activación de la maquinaria de splicing (McKie et al. 2001; Chakarova et al. 2002; Vithana et al. 2001). Desde entonces, numerosos estudios han intentado descifrar la naturaleza de este subtipo de RP generando más de 200 publicaciones en menos de 20 años. Sin embargo, a pesar del esfuerzo aún se desconocen los mecanismos que llevan a la muerte del fotoreceptor por apoptosis y el rol de factores de splicing ubicuos en el proceso, más aún tampoco se disponen de terapias que detengan o retrasen el progreso de la enfermedad.
Mientras tanto, en las últimas décadas, el nematodo Caenorhabditis elegans se ha ido abriendo camino en el campo de la investigación biomédica gracias a que posee características que lo convierten en un buen organismo modelo en el cual estudiar enfermedades humanas. Dado que RP es una retinopatía hereditaria de la cual se sabe muy poco en cuanto a los mecanismos que conducen al desarrollo de la enfermedad, nos atrajo la idea de modelarla en C. elegans. Para esto utilizamos técnicas como el ARN de interferencia (RNAi por sus siglas en inglés) y la edición del genoma por CRISPR/Cas9 para imitar la pérdida parcial de la función de estos genes que experimentan los pacientes con adRP.
Nuestro trabajo logró que C. elegans sea reconocido como un buen modelo en el cual estudiar el subtipo de RP asociado a factores de splicing (Rubio-Peña et al. 2015). Utilizando RNAi inactivamos parcialmente los factores de splicing mutados en adRP y realizamos el análisis fenotípico y de las secuencias obtenidas en la secuenciación del transcriptoma de los animales tratados. Contrario a lo esperado, el estudio del transcriptoma mostró una leve retención de intrones bastante similar a la observada en animales control sugiriendo que una inactivación parcial de estos factores del splicing no tiene un mayor efecto en el reconocimiento y eliminación de los intrones. Adicionalmente, el estudio de la expresión diferencial de genes en animales tratados con RNAi vs animales control mostró la sobre- expresión del gen pro-apoptótico egl-1. Estudios adicionales determinaron que esta sobre- expresión se producía en un tipo específico celular de la hipodermis del gusano y que desencadenaba el proceso apoptótico únicamente en estas células.
Así, se logró establecer un modelo de adRP asociada a mutaciones en factores de splicing (s-adRP) en C. elegans en el que se establecen similitudes importantes: (i) la pérdida parcial de la función estos factores del splicing no producen defectos en el splicing dramáticos, esto ha sido observado también en estudios con células de pacientes portadores de mutaciones en estos genes; (ii) la deficiencia en estos factores de splicing produce un efecto deletéreo en un tejido específico del organismo, siendo la retina en el hombre y la hipodermis en el gusano; (iii) este efecto se produce en los tejidos con mayor actividad transcripcional en cada caso, lo que sugiere que está asociado a transcripción; (iv) en ambos casos el resultado final es muerte celular por apoptosis.
Adicionalmente, el gen atl-1/ATR que codifica para una proteína que detecta daño en el DNA causado por exposición a UV o estrés replicativo también se encontraba sobre-expresado en estos gusanos. Estas observaciones nos llevaron a plantear un modelo en el que una maquinaria de splicing ineficiente afecta a la eficiencia de la maquinaria de transcripción provocando su estancamiento dentro del gen. Este estancamiento tendría como resultado la formación de estructuras secundarias de híbridos de RNA:DNA llamadas R-loops, lo que representaría una amenaza para la estabilidad genómica, podrían ser fuente de estrés replicativo lo que finalmente desencadenaría la respuesta apoptótica.
La posibilidad de editar el genoma utilizando la técnica CRISPR/Cas9 permitió la incorporación de mutaciones específicas detectadas en pacientes de s-adRP en el genoma del gusano en los genes prp-8 (R2303G y H2302del) y snrp-200 (V676L y S1080L). Así pudimos refinar aún más el modelo y utilizarlo no sólo para tratar de demostrar nuestro mecanismo de apoptosis asociado a mutaciones en ciertos factores de splicing, sino también para buscar posibles modificadores genéticos o químicos que puedan ser utilizados como terapia en un contexto de medicina personalizada.
Referencias Chakarova, C.F. et al., 2002. Mutations in HPRP3, a third member of pre-mRNA splicing factor genes, implicated in autosomal dominant retinitis pigmentosa. Human molecular genetics, 11(1), pp.87–92. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11773002 [Accessed May 26, 2017].
McKie, A.B. et al., 2001. Mutations in the pre-mRNA splicing factor gene PRPC8 in autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP13). Human molecular genetics, 10(15), pp.1555–1562. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11468273.
Rubio-Peña, K. et al., 2015. Modeling of autosomal-dominant retinitis pigmentosa in Caenorhabditis elegans uncovers a nexus between global impaired functioning of certain splicing factors and cell type-specific apoptosis. RNA, 21(12), pp.2119–2131. Available at: http://rnajournal.cshlp.org/lookup/doi/10.1261/rna.053397.115.
Vithana, E.N. et al., 2001. A human homolog of yeast pre-mRNA splicing gene, PRP31, underlies autosomal dominant retinitis pigmentosa on chromosome 19q13.4 (RP11). Molecular cell, 8(2), pp.375–81. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11545739 [Accessed May 26, 2017].
