Resumen de Enhancement of chemical diversity in fungal endophytes from arid plants of Andalusia
- español
Ha sido ampliamente descrito que los hongos representan una de las fuentes más prolíficas de nuevos productos naturales, pero los bajos rendimientos de producción y la falta de expresión de genes crípticos en condiciones estándar de laboratorio son factores limitantes clave para poder explotar al máximo el potencial metabólico de los hongos in vitro. Las comunidades nativas de plantas asociadas a zonas áridas presentan características distintivas para sobrevivir en tales condiciones extremas. El gran número de plantas endémicas muy poco estudiadas representa una fuente potencial única para el descubrimiento de nuevos hongos simbiontes, así como de endófitos específicos de su hospedador aún no descritos. Este trabajo representa el primer estudio donde se lleva a cabo el cultivo y la caracterización de hongos asociados a un extenso número de especímenes de plantas halófitas y xerofíticas de zonas áridas de Andalucía. Además, una vez caracterizada taxonómicamente la población de aislados fúngicos, el objetivo del estudio fue estimular y caracterizar su diversidad química en cuanto a producción de metabolitos secundarios aplicando diversas metodologías basadas en el cultivo, como la adición de resinas de adsorción polimérica, la utilización de modificadores epigenéticos de origen químico o mediante el co-cultivo de microrganismos provenientes del mismo nicho ecológico.
Para el presente trabajo se aislaron un total de 349 cepas fúngicas a partir de las 63 especies de plantas recolectadas en ecosistemas áridos ubicados en el sureste de Andalucía, caracterizándose tanto morfológicamente, como en base a sus secuencias ribosomales ITS y 28S. La comunidad de aislados fúngicos se distribuyó a lo largo de 19 órdenes taxonómicos, incluyendo basidiomicetes y ascomicetes, siendo Pleosporales el orden más abundante entre todos los aislados. Identificándose así un total de 107 géneros diferentes, siendo Neocamarosporium el género más frecuentemente aislado, seguido de Preussia y Alternaria. Para los aislados pertenecientes al género Preussia, se llevó a cabo, además, un estudio específico para revisar su taxonomía y caracterizar quimiotipos dentro de las especies de Preussia aisladas a partir de muestras de zonas áridas y otras muestras ambientales recolectadas dentro de toda la Península Ibérica. Se identificaron 16 biomarcadores y mediante un análisis combinado, se infirieron 11 quimiotipos que pueden ser usados para diferenciar especies de Preussia estrechamente relacionadas.
En lo referente a su capacidad de producir diversidad química mediante fermentación, las cepas se crecieron en primer lugar en cuatro medios de cultivo diferentes, tanto en presencia como en ausencia de resinas de adsorción seleccionadas para promover la generación de nuevos metabolitos secundarios. Los extractos obtenidos a partir de las fermentaciones se caracterizaron químicamente y se evaluaron en busca de nuevas actividades antifúngicas contra patógenos de plantas y humanos, así como actividades citotóxicas contra la línea celular de cáncer de hígado humano HepG2. De los 349 aislados analizados, 126 (36%) fueron capaces de generar extractos con actividades biológicas significativas, 58 con propiedades antifúngicas específicas y 33 cepas con actividades específicas en la línea celular de carcinoma hepatocelular HepG2. Tras analizar los extractos activos mediante LC-MS de baja y alta resolución, se pudieron identificar 68 metabolitos secundarios con actividad biológica conocía producidos por 96 de las cepas, además de 12 metabolitos secundarios potencialmente nuevos en un subconjunto de 14 de los hongos endofíticos.
Los inhibidores de histona desacetilasas (HDAC) y de ADN metiltransferasas (DNMT) son comúnmente utilizados con el fin de perturbar la producción de metabolitos fúngicos mediante la inducción de la expresión de rutas biosintéticas crípticas. Por lo tanto, se desarrolló una metodología sistemática para evaluar e identificar los posibles efectos de un batería de inhibidores de HDAC y DNMT en los perfiles metabólicos de los hongos del estudio. Además, análisis metabolómicos basados en datos de LCMS y representados mediante “Volcano-plots” fueron aplicados con el fin de determinar moléculas producidas diferencialmente entre condiciones de interés a comparar. Se llevo a cabo de esta manera la identificación y caracterización química de los metabolitos secundarios más significativos inducidos por el uso de modificadores epigenéticos para un subconjunto de los aislaos fúngicos.
El uso de co-cultivos también fue evaluado como una metodología para detectar relaciones antagonistas entre los aislados a parir de plantas de zonas áridas de Andalucía. Para este propósito, se realizó un cribado en busca de interacciones antagonistas entre la población de aislados mediante el co-cultivo de parejas de cepas sobre placas de agar y, posteriormente, se diseñó y desarrolló un método de extracción automatizado para determinar si en estos efectos antagónicos observados entre los aislados se inducían nuevos metabolitos secundarios o si estos se acumulaban espacialmente en la zona de la interacción. Se desarrollaron así técnicas de imagen por espectrometría de masas (MS) y ultravioleta (UV) para visualizar la distribución espacial de los metabolitos y facilitar la identificación de aquellos metabolitos secundarios inducidos gracias a las interacciones microbianas.
Además de caracterizar los perfiles químicos diferenciales de producción de metabolitos secundarios después de aplicar cada uno de estos tres enfoques basados en el cultivo de los aislados, y como prueba de concepto de la inducción potencial de nuevas estructuras químicas, se purificaron e identificaron 14 metabolitos secundarios inducidos únicamente tras aplicar estas aproximaciones. Las estructuras de seis de estos compuestos, algunos bioactivos, resultaron nuevas y se elucidaron en el presente trabajo.
Los resultados obtenidos confirman que la explotación de la riqueza microbiana asociada a las zonas áridas de Andalucía, combinada con la aplicación de métodos integrados de cultivo puede favorecer la activación de rutas metabólicas silentes en ellos y conducir al descubrimiento de nuevos productos naturales con actividad biológica y potencial para convertirse en cabezas de serie para el desarrollo de futuros agentes terapéuticos.
- English
It has been widely described that fungi represent one of the most prolific sources of novel NPs, but low production yields and the lack of expression of cryptic gene clusters in laboratory conditions are frequently key limiting factors for exploiting the full secondary metabolite potential of fungi in vitro. Native plant communities from arid areas present distinctive characteristics to survive in extreme conditions. The large number of poorly studied endemic plants represents a unique potential source for the discovery of novel fungal symbionts as well as host-specific endophytes not yet described. This work represents the first study culturing and characterizing the fungal symbiont community of an extensive number of halophytic and xerophytic plant specimens from arid areas of Andalusia. Moreover, once the populations of isolates were characterized, the aim of the study has been to stimulate and characterize their chemical diversity on secondary metabolites production by applying diverse culture-based methodologies: adding adsorptive polymeric resins, using small-molecule epigenetic elicitors and/or co-culturing microorganisms isolated from the same ecological niche.
A total of 349 fungal strains isolated from 63 selected plant species from arid ecosystems located in the southeast of Andalusia, were characterized morphologically as well as based on their ITS/28S ribosomal gene sequences. The fungal communities isolated were distributed among 19 orders including Basidiomycetes and Ascomycetes, with Pleosporales as the most abundant order. In total, 107 different genera were identified being Neocamarosporium the most frequently isolated genus, followed by Preussia and Alternaria. In the case of the Preussia isolates, a specific study was carried out to review their taxonomy and to characterize occurring chemotypes of Preussia species from arid and other environmental samples of the Iberian Peninsula. Sixteen natural compounds were identified and based on combined analyses, 11 chemotypes were inferred and could be used to resolve groups of closely related Preussia species.
Initially, strains were grown in four different media in presence and absence of selected resins to promote chemical diversity in the generation of new secondary metabolites. Fermentation extracts were chemically characterized and evaluated looking for new antifungal activities against plant and human fungal pathogens, as well as, cytotoxic activities against the human liver cancer cell line HepG2. From the 349 isolates tested, 126 (36%) exhibited significant bioactivities including 58 strains with exclusive antifungal properties and 33 strains with exclusive activity against the HepG2 hepatocellular carcinoma cell line. After LCMS analysis of the active extracts, 68 known bioactive secondary metabolites could be identified as produced by 96 strains, and 12 likely unknown compounds were found in a subset of 14 fungal endophytes.
Small molecule histone deacetylase (HDAC) and DNA methyltransferase (DNMT) inhibitors are commonly used to perturb the production of fungal metabolites leading to the induction of the expression of silent biosynthetic pathways. Thus, a systematic approach to evaluate and identify the possible effects of HDAC and DNMT inhibitors on the metabolic profiles of wild type fungal endophytes was developed. Metabolomics by volcano plot representations based on LC/MS was used to determine significant differences between two sets of samples from two different conditions of interest. Chemical identification and characterization of the most significant SMs induced by these epigenetic modifiers was performed with part of the isolates obtained.
Co-culture approach was also tested as a third way of inducing antagonist relationships between the isolates from plants of arid zones of Andalusia. For this purpose, a screening looking for antagonistic interactions among the population of isolates was performed by co-culturing the strains on agar plates in pairs. An automated extraction method was designed and developed to determine if these antagonistic effects observed between the isolates were induced by co-culturing and if the antifungal compounds were accumulating spatially in the interaction zone. Ultraviolet (UV) and Mass Spectrometry (MS) imaging techniques were developed to visualize the spatial distribution of metabolites and facilitated the identification of induced secondary metabolites upon the microbial interactions.
The chemical profiles of the differential expression after applications of these three culture-based approaches were compared. As proof of concept of induced new chemistry, fourteen induced secondary metabolites only produced under these approaches were purified and identified. The structures of six of these compounds, some of them bioactives, were new and herein elucidated.
Results confirmed that the exploitation of the microbial richness associated to arid areas of Andalusia, combined with the application of integrated culturing methods, can favour the activation of fungal cryptic metabolic pathways towards the discovery of new bioactive natural products with the potential to become new leads for the development of future therapeutic agents.
