Resumen de Fidelity of human immunodeficiency viruses type 1 and type 2 reverse transcriptases in DNA synthesis reactions using DNA and RNA templates

Alba Sebastián Martín

• español

  El síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) está causado por el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2, respectivamente). La mayoría de los fármacos antirretrovirales aprobados clínicamente para su uso contra la infección por el VIH actúan sobre la retrotranscriptasa (RT) viral. La RT es una enzima multifuncional con actividad ADN polimerasa dependiente de moldes ARN y ADN, así como con actividad ribonucleasa H. Los inhibidores de la RT análogos a nucleósido constituyen el eje central de las terapias actuales contra ambos tipos de VIH. En la RT del VIH-2, la combinación de cambios de aminoácido K65R, Q151M y M184V confiere resistencia a todos los análogos a nucleósido aprobados. Cabe destacar que en RTs de VIH-1 muy divergentes, la mutación K65R confiere por sí misma >8 veces mayor fidelidad en la síntesis de ADN. En esta Tesis, hemos determinado la fidelidad intrínseca para la síntesis de ADN dependiente de moldes de ADN de la RT de tipo salvaje (WT) del VIH-2, grupo A, cepa ROD y de las RTs mutantes K65R y K65R/Q151M/M184V. Nuestros resultados mostraron que estos cambios tienen un efecto relativamente pequeño (menos de 2 veces) en la selectividad de nucleótido de la RT del VIH-2ROD. Una conformación diferente de la horquilla β3-β4 en las RTs del VIH-1 y VIH-2 probablemente podría explicar los diferentes efectos de K65R.

  Además de su importancia en la infección natural, las RTs también se utilizan ampliamente en biotecnología por su capacidad de sintetizar ADN complementario utilizando ARN como molde. Se ha estudiado ampliamente la fidelidad intrínseca de la síntesis de ADN dependiente de ADN. En ensayos genéticos basados en la expresión del gen lacZα del fago M13mp2, las RTs WT del VIH- 1, grupo M, subtipo B mostraron tasas de error >10 veces mayores que el virus de la leucemia de ratón (MLV) y el virus de la mieloblastosis de aves (AMV). En esta Tesis se han determinado las tasas de error de síntesis de ADN dependiente de ARN para varias RTs, incluyendo las de los virus WT del VIH-1BH10, VIH-1ESP49, AMV y MLV, y las RTs de alta fidelidad del VIH-1ESP49 con los cambios K65R y K65R/V75I. Nuestros resultados muestran diferencias de menos de 2 veces en la fidelidad de estas RTs, con valores de tasas de error entre 2.5×10-5 y 3.5×10-5. Estos resultados fueron consistentes con la existencia de un umbral de error de la transcripción, generado por la ARN polimerasa al sintetizar el ARN utilizado como molde en el ensayo. Se logró una reducción modesta pero consistente del umbral de error al disminuir el pH y la concentración de Mg2+ de la reacción de transcripción. A pesar de las limitaciones del ensayo, concluimos que las RTs del VIH-1BH10 y VIH- 1ESP49 son menos precisas cuando se copian moldes de ADN que de ARN. El análisis de los espectros de mutación dependientes de ARN reveló una mayor tendencia a introducir deleciones largas al inicio de la retrotranscripción en todas las RTs del VIH-1, excepto la del doble mutante K65R/V75I.

  Los datos proporcionados por secuenciación masiva muestran también diferencias similares en la fidelidad entre las RTs del VIH-1BH10 y del doble mutante K65R/V75IESP49.

• English

  Human immunodeficiency viruses type 1 and 2 (HIV-1 and HIV-2, respectively) are the causative agent of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Most of the available clinically approved antiretroviral drugs directed against HIV inhibit the viral reverse transcriptase (RT), a multifunctional enzyme with RNA- and DNA-dependent DNA polymerase activity, as well as ribonuclease H, strand-transfer, and strand displacement activities. Nucleoside RT inhibitors (NRTIs) constitute the backbone of current therapies against both types of HIV, although the acquisition of NRTI resistance is mediated by the development of different mutational pathways. In HIV-2, resistance to all approved nucleoside analogues is conferred by the combination of RT substitutions K65R, Q151M and M184V. Interestingly, in highly divergent HIV-1 RTs, K65R alone confers >8-fold increased accuracy of DNA synthesis. In this Thesis, we have determined the intrinsic fidelity of DNA synthesis of wild-type (WT) HIV-2 group A (strain ROD) RT and mutants K65R and K65R/Q151M/M184V. Our results show that in HIV-2ROD RT those changes have a relatively small impact on nucleotide selectivity. Furthermore, we found that there were less than 2- fold differences in error rates obtained with forward mutation assays using mutant and WT HIV- 2ROD RTs. A different conformation of the β3-β4 hairpin loop in HIV-1 and HIV-2 RTs could probably explain the different effects of K65R.

  In addition to its importance in natural infection, RTs are also widely used in biotechnology for their capacity to synthesize complementary DNA using RNA as templates. Intrinsic fidelity of RT’s DNA-dependent DNA synthesis has been extensively studied. In M13mp2 lacZα forward mutation assays, WT HIV-1 RTs of group M/subtype B showed >10-fold higher error rates than murine leukemia virus (MLV) and avian myeloblastosis virus (AMV) RTs. This Thesis aimed to determine error rates for RNA-dependent DNA synthesis catalyzed by several RTs, including WT HIV-1BH10, HIV-1ESP49, AMV and MLV RTs, and the high-fidelity mutants of HIV-1ESP49 RT K65R and K65R/V75I. Our results show that these retroviral RTs have less than 2-fold differences in fidelity, with error rates in the range of 2.5 × 10−5 and 3.5 × 10−5. These results were consistent with the existence of a transcriptional inaccuracy threshold, generated by the RNA polymerase while synthesizing the RNA template used in the assay. A modest but consistent reduction of the inaccuracy threshold was achieved by lowering the pH and Mg2+ concentration of the transcription reaction, needed to synthesize the RNA template. Despite assay limitations, we concluded that HIV- 1BH10 and HIV-1ESP49 RTs are less accurate when copying DNA templates than RNA templates.

  Analysis of the RNA-dependent mutational spectra revealed a higher tendency to introduce large deletions at the initiation of reverse transcription by all HIV-1 RTs except the double-mutant K65R/V75I. Data provided by deep sequencing experiments also showed similar differences in accuracy between HIV-1BH10 and K65R/V75IESP49 RTs.