Implicación del elemento hnf1 y de otros motivos de unión en la transcripción alternativa del gen de ae2 (slc4a2) en células hepáticas

• Autores: Raquel Malumbres Equísoain
• Directores de la Tesis: Juan Francisco Medina Cabrera (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Navarra ( España ) en 2002
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jesus M. Prieto Valtueña (presid.), Ana Rouzaut Subirá (secret.), Iñigo Lasa Uzcudun (voc.), Luís Torres Asensi (voc.), Ignacio José Encio Martínez (voc.)
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• Resumen

  • INTRODUCCIÓN El propósito de este trabajo es el estudio de la transcripción alternativa hepática del gen de AE2 (SLC4A2), miembro de la familia de intercambiadores de aniones indpendientes de sodio. Este gen se transcribe en la mayor parte de los tejidos desde el promotor 5', dando lugar a la isoforma AE2a. Por otro lado, dentro del intrón 2 existen dos promotores alternativos solapantes que dirigen la expresión de dos variantes N-terminales más cortas, AE2b1 y AE2b2, de un modo específico de tejido, fundamentalmente en hígado y riñón.

    MÉTODOS La actividad promotora se evaluó por medio de ensayos duales de luciferasa en células transfectadas transitoriamente (líneas celulares HepG2, derivada de hepatoma, y PC-3, derivada de cáncer de próstata). Los fragmentos de las regiones promotoras se obtuvieron mediante PCR con la DNA polimerasa Pfu y se introdujeron en el vector de luciferasa pGL3-basic. Las sondas para los ensayos de retraso de banda y supershift se marcaron con digoxigenina y se detectaron mediante revelado no isotópico.

    RESULTADOS Un fragmento de DNA de 0,3 kb que incluye el promotor proximal y los sitios de inicio de la transcripción de la isoforma AE2b2, resultó especialmente activo en los ensayos de luciferasa en células HepG2. Entre otros posibles motivos de unión de factores de transcripción, la mayoría para factores de transcripción abundantes en hígado, esta región contiene una variante de 1 pb de la secuencia de 15 pb del elementos consenso HNF1 (Hepatocyte Nuclear Factor 1). Una mutación de 6 pb en este elemento consenso produce un descenso muy acusado en la actividad promotora en células HepG2, mientras que no tiene efecto en células PC-3. Mediante ensayos de retraso de banda y supershift se observa que el factor de transcripción HNF1alfa es capaz de unirse a nuestro elemento HNF1. Además, la actividad transcripcional del construido no mutado en células PC-3 se potencia tras