Desarrollo de vacunas marcadas con GFP frente a la brucelosis ovina y tests diagnósticos asociados

• Autores: Ana Zabalza Aznárez
• Directores de la Tesis: Mª Jesús Grilló Dolset (dir. tes.), Beatriz San Ramón Aberasturi (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Pública de Navarra ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ana Arana Navarro (presid.), Virginia Aragón Fernández (secret.), Antonio Sanz Fernández (voc.)
• Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Biotecnología
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
      • Fisiología bacteriana
  • Ciencias agrarias
    • Ciencias veterinarias
      • Inmunología
      • Microbiología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Academica-e
• Resumen

  • La brucelosis es una zoonosis extendida mundialmente con importantes repercusiones económicas y santtarias, 1 cuya principal fuente de infección para el ser humano son los pequeños rumiantes infectados por Bruce/la melitensis. En gran parte del mundo, ef control de la brucelosis en estos animales debe basarse en la vacunación. B. melitensis Rev1 es la única vacuna disponible y recomendada internacional mente para ovejas y cabras. Sin embargo, la vacunación con Rev1 genera una interferencia serológica que impide la Diferenciación entre Animales Infectados y \ Vacunados (DIVA), limitando el uso de esta cepa vacuna!. Para tratar de solventar el problema DIVA, se ha desarrollado una técnica de marcaje xenogénico con la proteína de origen marino GFP. En el Capítulo 1 de esta Tesis, se obtuvieron dos isoformas de GFP recombinante y se desarrollaron tests serológicos utilizando dichas \ proteínas como antígeno diagnóstico. En el Capítulo 2, se realizó el marcaje xenogénico de Rev1 con gfp mediante • la inserción cromosómica dirigida de un mini-Tn?-gfp (Rev1::gfp) y un análisis serológico detallado, tanto en ratones BALB/c como en ganado ovino. La estrategia de vacunación con Rev1::gfp en mezcla con GFP y un booster posterior con GFP en hidróxido de aluminio, permitió identificar durante más de 6 meses post-booster, a todos los animales que habían sido vacunados, utilizando las técnicas serológicas oficiales anti-LPS-S y un íELISA-GFP.

    Además, la vacuna clásica Rev1 posee otros inconvenientes como son su poder patógeno residual y resistencia a la 1 estreptomicina, que recomiendan la búsqueda de nuevas vacunas frente a B. melítensis. Para ello, en el Capítulo 3 se construyeron y caracterizaron los candidatos vacunales 16Mil.wzm y 16Mil.wzm: :gfp, con LPS-R, a la vez que acumulan PS-0 en el interior bacteriano, y sensibles a estreptomicina. Estas propiedades confirieron una atenuación y eficacia frente a B. melitens s en ratones similares a las de Rev1. En corderos, la vacunación combinada de 16Mil.wzm: :gfp con GFP generó una mínima interferencia en las pruebas convencionales con LPS-S y permitió identificar a los anímales vacunados mediante íELISA-GFP, sin necesidad de booster. j 1. Por otra parte, Rev1 ha permitido controlar la infección por Bruce/la av s. En las zonas donde se ha abandonado la vacunación con Rev1, B. avis es una patógeno emergente que causa graves pérdidas económicas. Puesto que no \ existe una vacuna especffica frente a B. avis, el Capítulo 4 se centró en analizar las propiedades vacunales de una selección de cinco mutantes rugosos de B. melítensis obtenidos en un proyecto anterior, mediante inserción aleatoria del míni-Tn5. De ellos, se seleccionaron y construyeron por deleción en fase las cepas marcadas 16Mil.wzm::gfp (Capítulo 3) y H38il.wbkF::gfp (Capitulo 4). Además, se seleccionó un mutante de B. ovis PA que había mostrado buenas propiedades en el modelo muríno en un trabajo anterior, para su marcaje con el mini-Tn?-gfp, generando la cepa BoPAi.\omp10i\.ugpBil.omp31::gfp. La vacunación con una de estas cepas marcadas, tanto por vía intraperítoneal como subcutánea, evidenció mejor protección con los mutantes de B. me/itensis que con el triple mutante de B. avis en el modelo murino. Finalmente, se evaluó la inocuidad y respuesta serológica de 16Mil.wzm::gfp y BoPAAomp10i>.ugpBf>.omp31::gfp en ganado ovino, tras la vacunación combinada del mutante con GFP y posterior booster con GFP en hidróxido de aluminio, siguiendo el protocolo descrito en el Capítulo 2. Al igual que con '\ Rev1::gfp, esta estrategia permitió identificar por íELISA-GFP a todos los animales que habían sido vacunados, , durante más de 4 meses post-booster.

    En conjunto, por un lado, el marcaje de Bruce/la con el míni-Tn7-gfp permitió conservar las propiedades microbiológicas y vacunales que poseían los correspondientes mutantes antes de ser marcados y, a su vez, permitió identificarlos fácilmente por visualización directa de la ftuorescencía y por u_na PCR-GFP múltiple espcífícamente diseñada. Por otro lado, Rev1::gfp y 16ML'lwzm::gfp parecen buenas alternativas a Rev1 frente a tnfecctones por B.