Resumen de Estructura-función del transportador neuronal de glicina GlyT2: localización del sitio Na3 y determinantes de inhibición
La glicina cumple un papel dual en el sistema nervioso central de los vertebrados, actuando como neurotransmisor inhibidor en áreas caudales y como coagonista del glutamato en los receptores NMDA de las sinapsis excitadoras. La acción de la glicina finaliza cuando es retirada de la hendidura sináptica por medio de transportadores específicos de alta afinidad, GlyT1 mayoritariamente glial y GlyT2 neuronal. Los GlyTs llevan a cabo el transporte activo de glicina acoplado al gradiente electroquímico de Na+ y dependiente de cloruro, pero ambas isoformas difieren en su estequiometría y, en consecuencia, en su función. GlyT2 co-transporta un Na+ adicional por cada molécula de glicina, esto le otorga una mayor capacidad concentrativa y dificulta el transporte reverso. El Na+ se une a los GlyTs en dos sitios de unión conservados (Na1 y Na2), pero la localización del sitio adicional en GlyT2 (sitio Na3) se desconoce, aunque se ha propuesto la implicación del Glu650. En este trabajo, empleando simulaciones de dinámica molecular sobre un modelo de GlyT2 construido por homología con el transportador de dopamina de Drosophila melanogaster (dDAT), se han propuesto dos posibles localizaciones. Las predicciones in silico, junto con los datos experimentales obtenidos mediante el análisis bioquímico y electrofisiológico de los mutantes de los GlyTs generados, han proporcionado evidencias que confirman que el tercer Na+ en GlyT2 estaría coordinado por el Glu250 y el Glu650. Además, la alteración del efecto del litio obtenido en los mutantes sugiere que dicha region contiene propiedades alostéricas implicadas en la selectividad catiónica del transportador. La sustitución del Glu650 por la metionina correspondiente en GlyT1 (GlyT2-E650M), reduce la ratio carga/flujo al nivel de la obtenida para GlyT1 sin generar un desacoplamiento iónico en del transporte. La estimación del potencial de reversión para el mutante GlyT2-E650M, concuerda con un cambio en la estequiometría. Además, el mutante muestra una independencia de cloruro del transporte de glicina, recuperable con la sustitución conjunta del Glu250 y Glu650 por aminoácidos neutros, sugiriendo un acoplamiento alostérico entre el sitio Na3 y el sitio de unión a cloruro específico en GlyT2. Además, dada la importancia farmacológica de los GlyTs derivada de su implicación en el mantenimiento de la homeostasis entre excitación e inhibición en varios circuitos neuronales, nos planteamos conocer el sitio de interacción del ALX 1393, un inhibidor específico de GlyT2 que ha mostrado tener un efecto analgésico en modelos animales de dolor. De esta forma se ha establecido que el ALX 1393 se uniría al sitio primario de unión de la glicina (S1), estabilizándose por la unión a residuos de los transmembrana 1, 3, 6 y 8. Además se ha comprobado que la N-glicosilación del bucle extracelular 2 podría afectar de manera negativa a la accesibilidad del inhibidor al centro activo de la molécula.
Por último, el estudio preliminar del mecanismo de inhibición deja abierta la posibilidad de que la presencia del inhibidor en el sitio S1 permita la transición a la conformación ocluida del transportador.
