Herramientas para el estudio del dolor

• Autores: Maite Artero Morales
• Directores de la Tesis: Antonio Vicente Ferrer Montiel (dir. tes.), Gregorio J. Fernandez Ballester (tut. tes.)
• Lectura: En la Universidad Miguel Hernández de Elche ( España ) en 2018
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Asia Fernández Carvajal (presid.), Francisco José Taberner Sanchis (secret.), V. Moreno Manzano (voc.), Marco Caprini (voc.), Pilar de la Peña Cortines (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Celular por la Universidad Miguel Hernández de Elche
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
      • Cultivo celular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RediUMH
• Resumen

  • El dolor es una de las principales patologías del ser humano cuyo tratamiento, en determinadas condiciones, todavía resulta limitado o ineficaz. La percepción del dolor es el resultado de un complejo procesamiento de señales moleculares y bioquímicas en los diferentes niveles del sistema nervioso. La identificación de diferentes proteínas, canales iónicos y receptores, implicados en la conversión de las señales nocivas a potenciales de acción (transducción) ha permitido establecer nuevas dianas terapéuticas para el control de éste. Entre los canales iónicos responsables de la transducción, destacan algunos miembros de la familia de receptores de potencial transitorio (TRP). Sin embargo, la caracterización de estas dianas ha derivado en un aún restringido número de nuevas terapias analgésicas. Sin embrago, la necesidad de ahondar en los mecanismos de regulación de estos canales iónicos para un desarrollo de terapias más eficientes se encuentra con distintos impedimentos instrumentales y metodológicas. Por ejemplo, la falta de sistemas in vitro provoca la dependencia de cultivos celulares primarios para el estudio de estos mecanismos. Además, la alta heterogeneidad en las neuronas sensoriales periféricas supone un factor limitante para entender los mecanismos bioquímicos, moleculares y celulares implicados en la sensibilización de los nociceptores por los diferentes compuestos algésicos. En este trabajo se han intentado crear nuevas herramientas in vivo e in vitro que permitan investigar de forma precisa los mecanismos de sensibilización, potenciación, cronificación y/o respuesta a las terapias analgésicas. Dichas herramientas se corresponden, por un lado, con la generación de un modelo animal transgénico que exprese el canal iónico TRPV1 ligado a la proteína fluorescente amarilla (YFP) por el N-terminal del canal. Por otro lado, se ha trabajado en el desarrollo de un modelo celular que permita la obtención de nociceptores in vitro. Se trató de acelerar el desarrollo de ambas herramientas con la implementación del sistema de modificación genética CRISPR/Cas9. Para la generación del modelo animal se llevó a cabo la modificación por recombinación homóloga de células madre microinyectadas en blastocistos. La caracterización de la generación heterocigota se llevó a cabo ante la carencia de una generación homocigota para YFP-TRPV1. Sin embargo, la generación heterocigota no permitió confirmar la expresión de la YFP-TRPV1 ni a través de PCRs en los análisis de tránscritos, ni a través de Western Blot e Inmunocitoquímica en los análisis de expresión de proteína. Los resultados obtenidos muestran la necesidad de continuar investigando el papel de TRPV1 en el desarrollo animal, así como la regulación de su expresión génica, la función de los distintos reordenamientos y las modificaciones post transcripcionales que se producen en el canal y que pudieran estar afectando a la creación del modelo homocigoto. La implementación del uso de nuevas herramientas de modificación genética, tales como CRISPR/Cas9 se llevó a cabo para solventar los problemas de generación del modelo animal. En esta tesis se demuestra cómo, al menos en línea celular, es posible la introducción de una proteína fluorescente en el C-terminal de TRPM8 con la transfección de 2 plásmidos y la selección de clones en un periodo relativamente corto de tiempo. En este sentido, la tecnología CRISPR desarrollada hace viable la generación de un modelo celular con las mismas alteraciones que las planteadas para el modelo animal. Para el desarrollo del modelo celular se partió de la línea celular MED17.11, potencialmente diferenciable a nociceptores adultos. En este trabajo se pone en cuestión, sin embargo, el uso de esta línea celular como modelo in vitro en la investigación del dolor. A pesar de los cambios morfológicos observados con los diferentes protocolos de diferenciación llevados a cabo, la línea celular carecía de la expresión de marcadores neuronales maduros, así como una casi completa falta de respuesta a estímulos inductores de potenciales de acción. Los resultados obtenidos concluyen que esta línea celular podría ser usada en estudios exclusivamente de neurogénesis.