Resumen de Expresión, purificación, localización y silenciamiento génico de los cofactores de la beta-tubulina: tbca, tbcd y arl2
El citoesqueleto de microtúbulos está constituido por microtúbulos y proteínas accesorias. Los microtúbulos son polímeros de tubulina, un heterodímero constituido por una molécula de alfa y otra de betatubulina. Tanto la síntesis de los monómeros como la formación del heterodímero son procesos complejos y finamente regulados ya que es necesario asegurar el correcto plegamiento de este para que pueda incorporarse al microtúbulo. En estos procesos además de prefoidina y CCT (que también participan en el plegamiento de actina), están implicados hasta cinco cofactores (p14oCoA, CoB, CoC, CoD y CoE) y la proteína Arl2.P14, CoD y Arl2 participan en el plegamiento de la Beta tubulina.
El objetivo principal de la tesis es el estudio de la función de Arl2. Se ha clonado el gen humano en vectores de expresión lo que ha permitido purificar la proteína recombinante. También se han producido anticuerpos policlonales específicos que se utilizarán para determinar la localiación a nivel histoquímico e intracelular de Arl2 en diferentes tejidos y líneas celulares utilizando técnicas inmunocitoquímicas.
Además se estudiará la función de p14 en células de mamífero mediante ensayos de inhibición de su síntesis utilizando técnicas de silenciamiento genético.
Objetivos: Clonaje de Arl2 en los vectores adecuados para su expresión en bacterias y células ecucarióticas, tanto en su forma 'mild type' como en un 'taG' de histidinas para facilitar su purificación.
Producción y purificación de la proteína recombinante.
Estudio bioquímico, inmunocitoquímico e inmunohistoquímico de la expresión de Arl2 en diferentes tejidos y lineas celulares.
Producción del complejo Arl2-Cod mediante coinfección de células Sf9 con baculovirus recombinantes.
Producción y purificación de p14 según la metodología descrita.
Estudio del efecto de la inhibición de la síntesis de p14 y Arl2 mediante siRNA en líneas celulares apropiadas que se investigan.
