Estudio de la estabilidad conformacional de un anticuerpo monoclonal y de su fragmento de cadena sencilla

• Autores: Idolka Pedroso Izquierdo
• Directores de la Tesis: Javier Sancho Sanz (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2006
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel Cortijo Mérida (presid.), Adrian Velazquez Campoy (secret.), Fermin Lampreave Palacios (voc.), Jose Luis Neira Falairo (voc.), Milagros Medina Trullenque (voc.)
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• Resumen

  • Durante la tesis se estudió la estabilidad de dos proteínas: el anticuerpo monoclonal (AcM) CB HEP1 y su fragmento variable (scFv CB HEP1).

    El AcM CB HEP1 es un anticuerpo específico contra el virus de superficie del virus de a Hepatitis B. Esta proteína, es obtenida de ratón, se utiliza como ligando de afinidad en el proceso productivo de una vacuna recombinante contra la Hepatitis B. El scFv , es obtenido por vía recombinante y obtenido a partir de las secuencias del AcM CB HEP1 y contiene la secuencias que permiten la función biológica de reconocimiento del antígeno de superficie de la hepatitis B.

    Por motivos económicos, se desea sustituir en el proceso productivo el AcM CB HEP1 por su scFv CB HEP1. No obstante, el scFv tiene problemas de estabilidad, y por este motivo se estudió la estabilidad de ambas proteínas. Estos estudios permitirían determinar los factores que influyen en la estabilidad del scFv CB HEP1.

    La estabilidad de ambas proteínas se estudió mediante la reacción de desnaturalización térmica y por urea. El desarrollo de la reacción fue seguida por fluorescencia y por DC en el UV cercano y lejano.

    Estos estudio permitieron establecer para cada proteína tanto para la reacción de desnaturalización por urea como por temperatura: el modelo mínimo que explica la reacción, las condiciones de pH y concentración de temperatura que favorecen la estabilidad de cada proteína. El ajuste de las curvas de desnaturalización permite obtener la energía que permite el cambio de estado y determina la estabilidad de cada proteína.

    La reacción de desnaturalización del scFv CB HEPI por urea resultó totalmente reversible, mientras que la desnaturalización por temperatura no. La reacción de desnaturalización fue cooperativa y El modelo mínimo que explica la desnaturalización del scFv HEP1 tanto por urea como por temperatura es de 4 estados: el estado nativo, el intermediario 1, el intermediario2 y el estado desnaturalizado. Sin embargo la estructura secundaria y terciaria de estos tres últimos estados varía dependiendo si la desnaturalización es realizada por urea o por temperatura.

    La reacción del AcM CB HEP ldesnaturalización por temperatura resultó reversible si esta se desarrolla hasta cierto valor de temperatura. El modelo mínimo que explica la desnaturalización por temperatura es de 5 estados: el estado nativo, el intermediario 1, el intermediario 2, el intermediario 3 y el estado desnaturalizado. La urea produce la agregación de la proteína incluso a baja concentración de proteína lo que impide que la reacción se desarrolle en el equilibrio. La proteína precipita en un amplia rango de pH a partir de determinado valor de temperatura.

    Por último, se obtuvo el modelo de la estructura tridimensional del scFv CB HEP1. Para ello se utilizó la estructura de las proteínas cuya secuencias guardaron mayor homología con la del scFv y cuya estructura se encuentra publicada en la base de datos PDB. Las curvas de estabilidad por urea (reacción de desnaturalización) y el modelo de la estructura tridimensional del scFv CB HEPI permitieron clasificar a esta proteína según su estabilidad y concluir que la región la cadena ligera variable VL es la que limita la estabilidad de la proteína.