Resumen de Estudio bioquímico y fisiopatológico de la itih4, una nueva proteína de fase aguda positiva en la especie bovina
Estado de la cuestión:
Las proteínas de fase aguda (PFA) son proteínas plasmáticas cuya concentración se altera significativamente en enfermedades infecciosas y en los procesos inflamatorios. La medida de la concentración de estas proteínas en suero o plasma se utiliza ya como método para el seguimiento de la salud y del bienestar en diferentes especies, incluída la humana. El equipo de la Universidad de Zaragoza es pionero en esta investigación, y ha estudiado extensamente la respuesta de PFA. Resultado de este estudio, ha sido la caracterización de una nueva proteína de fase aguda, llamada ITIH4 (cadena pesada H4 de la familia de inhibidores inter-alfa), cuya función biológica es todavía desconocida.
Objetivos y metodología:
Los objetivos concretos a realizar en este trabajo se describen a continuación con mayor detalle:
1.- El aislamiento y la caracterización de la ITIH4 bovina en muestras biológicas (suero y leche).
2.- La obtención de antisueros y anticuerpos específicos para la ITIH4 bovina y para otras PFAs.
3.- Determinar si la ITIH4 bovina es una PFA positiva. Para ello se ha estudiado la variación de la concentración de la proteína en suero y leche tras la inducción experimental de la respuesta de fase aguda. Se ha determinado su concentración durante el curso de infecciones experimentales bacterianas y víricas. Además de la cuantificación de la ITIH4, se ha determinado la concentración de otras PFAs bien caracterizadas en la vaca como controles de la fase aguda y también se ha analizado la respuesta de la apolipoproteína A-I, una nueva PFA negativa en el cerdo.
4.- El desarrollo de métodos de medida eficaces como la inmunodifusión radial y el ELISA para la cuantificación de la proteína ITIH4 en suero y leche.
5.- Medida de la concentración de la ITIH4 en leche de vacas afectadas de mastitis.
6.- El análisis de la expresión de la ITIH4 y de la apolipoproteína A-I en células somáticas de leche y tejidos bovinos (RT-PCR, microscopía confocal).
Las muestras de campo se obtienen a través de la colaboración de nuestro grupo con el Dr. Javier Gallart (A.I.L.A) y el Dr. Juan Marco (Departamento de Sanidad del Gobierno Vasco). Se pretende además analizar la respuesta de ITIH4 en otras patologías bovinas, utilizando modelos experimentales, como el síndrome respiratorio bovino, en colaboración con el laboratorio del Dr. P. Heegaard del Danish Veterinary Institute, Copenhague (Dinamarca) y en mastitis, en colaboración con la Dra. S. Pyöräla de la Universidad de Helsinki (Finlandia).
Conclusiones De los resultados obtenidos en el presente estudio se deducen las siguientes conclusiones principales:
1.- Se ha aislado y caracterizado la proteína ITIH4 bovina de suero y leche. El protocolo de aislamiento de la ITIH4 basado en el uso de cromatografías de afinidad ha resultado ser más eficaz que el basado en cromatografías convencionales.
2.- Se han desarrollado dos procedimientos para la cuantificación de la ITIH4 en suero y leche. El primero es un método inmunoquímico (inmunodifusión radial) y el segundo es inmunoenzimático, un ELISA tipo sandwich.
3.- El método ELISA anterior está basado en el uso de anticuerpos monoclonales como anticuerpos de captura y anticuerpos policlonales marcados con peroxidasa como anticuerpos detectores. El procedimiento permite determinar la ITIH4 tanto en suero como en leche, en un rango de 0,027-0,85 µg/ml, con un coeficiente de variación interno y externo de 9 y 12% respectivamente.
4.- La concentración de la ITIH4 ha sido determinada en el suero y leche de vacas sometidas a diferentes infecciones experimentales bacterianas y víricas. En todos los casos, a los pocos días del estímulo la concentración de la proteína en suero experimenta un aumento de hasta doce veces su concentración inicial en los animales más afectados, comportándose como una PFA positiva moderada, mientras que en leche hay aumentos significativos de su concentración a las pocas horas del estímulo. La variación de los niveles de la proteína muestra correlación con la sintomatología clínica de las vacas y con los aumentos en la concentración de otras PFAs bovinas bien caracterizadas, como HPT y SAA. La apo A-I ha sido cuantificada también en estos modelos experimentales. La concentración sérica de esta proteína se redujo hasta un 20% respecto a su concentración inicial, comportándose como una PFA negativa. En la leche, al igual que la ITIH4, aumentó mucho su concentración pocas horas después de la infección.
5.- La determinación mediante ELISA de la concentración de la ITIH4 en leche de vacas con mastitis en diferente grado de afectación, puede servir para la detección temprana de la enfermedad, complementando la información obtenida por los tests actuales.
6.- Se ha estudiado por primera vez la expresión de la ITIH4 y de la apo A-I en células somáticas de leche y en glándula mamaria. En todas las muestras analizadas, se detectaron mRNAs de ITIH4 y apo A-I, excepto en las células somáticas de leche de vaca sana, en las que no hubo expresión de ITIH4.
7.- Se ha realizado un estudio de la inmunolocalización de la ITIH4 bovina por microscopía confocal de fluorescencia en células de leche procedentes de vacas sanas y vacas afectadas de mastitis. El marcaje de la ITIH4 en células de leche de vacas enfermas fue más intenso y estuvo repartido por toda la célula, mientras que el marcaje de la proteína en células de leche de vacas sanas, fue menos intenso y se concentró mayoritariamente en el citoplasma.
