Evidencias de la implicación de una cascada de señalización celular regulada por map quinasa (erk) en la capacitación de espermatozoides ovinos
- Autores: Carmen Colás Esteban
- Directores de la Tesis: María Teresa Muiño Blanco (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel López Pérez (presid.), Acisclo Perez Martos (secret.), Álvaro Sánchez Ferrer (voc.), Alfonso Gutiérrez Adán (voc.), Mario Ollero Ojeda (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Los experimentos presentados en esta tesis se diseñaron con el objetivo de incrementar el escaso conocimiento que se tiene de la capacitación del espermatozoide ovino.
Es bien conocido que las bajas temperaturas afectan a la función espermática y que el espermatozoide ovino es más sensible al choque térmico por frío (cold-shock) que el de otras especies, como son el espermatozoide de toro, conejo, o humano. En esta tesis se presentó un método innovador de inclusión de suspensiones celulares para microscopía electrónica de transmisión, basado en el uso de tejidos animales como containers biológicos, que evitaba las centrifugaciones, con objeto de poder preservar la estructura de la célula a estudiar. Gracias a este método, se pudo probar que las proteínas del plasma seminal protegían del daño por frío, y que su adición antes del tratamiento de cold-shock incrementaba la integridad de membrana del espermatozoide ovino.
Tanto la longevidad como la capacidad fecundante están mermadas en el espermatozoide de mamífero criopreservado, y se ha sugerido que es debido a un estado de capacitación prematura. Además, ciertas características del espermatozoide capacitado o sometido a cold-shock se han considerado fenómenos de tipo apoptótico. Por tanto, determinar si ciertas características consideradas como marcadores apoptóticos en células somáticas también ocurren en el espermatozoide ovino, así como sus posibles cambios durante la capacitación in vitro, era de gran interés. Así, pudo comprobarse que tanto la capacitación in vitro como el tratamiento de cold-shock tenían efectos similares en el espermatozoide ovino, puesto que ambos indujeron un incremento en la fragmentación del DNA (espermatozoides positivos a TUNEL), una reducción de la actividad de las Caspasas-3 y -7, y una pérdida parcial de actina del área acrosomal.
La capacitación espermática es un proceso de maduración que el espermatozoide experimenta durante su residencia en el tracto reproductor femenino. Durante la capacitación, tienen lugar una serie de profundos cambios bioquímicos y biofísicos mediante los cuales el espermatozoide adquiere su capacidad fecundante. Dado el paralelismo entre el efecto del cold-shock y la capacitación, se investigó cómo el espermatozoide ovino se capacita in vitro, así como los mecanismos moleculares que regulan este proceso, trabajo que contituyó el grueso de esta tesis. Se comenzó diseñando un medio que estimulara fertemente la capacitación espermática ovina, analizando el estado de capacitación mediante el patrón de CTC y la fosforilación de proteínas en residuos de tirosinas, basado en incrementar los niveles intracelulares de cAMP.
El espermatozoide ovino, antes de la capacitación, presentó proteínas fosforiladas en residuos de tirosina, serina, y treonina, principalmente a nivel ecuatorial. Asociado al proceso de capacitación in vitro, aparecieron, a lo largo de todo el flagelo, nuevos residuos fosforilados.
Mediante el uso de activadores específicos, se comprobó que la adenilato ciclasa soluble participaría en la capacitación del espermatozoide ovino, pues el análogo de adenosina, 2-chloro-2¿-deoxyadenosine, incrementó los niveles de cAMP e indujo la capacitación in vitro. También la adenilato ciclasa transmembrana estaría implicada, pues su activación por forskolin incrementó la fosforilación en residuos de tirosina durante la capacitación.
La PKA es una de las dianas más importantes del cAMP, y su implicación en la capacitación del espermatozoide ovino quedó demostrada cuando se comprobó que su inhibición con H89 anulaba parcialmente la capacitación inducida por los altos niveles de cAMP. No obstante, parte de la fosforilación de proteínas asociada a la capacitación in vitro en espermatozoide ovino resultó ser independiente de otros cambios regulados por la PKA, y por tanto, ambos procesos podrían operar por rutas al menos parcialmente separadas. Por ello, se investigó la implicación de una ruta de señalización celular, diferente de la ruta cAMP/PKA, en la capacitación espermática ovina, describiendo, por primera vez, que la MAP quinasa ERK participaría en la capacitación in vitro del espermatozoide ovino y estaría fuertemente activada por altos niveles de cAMP. También, se demostró que el EGF inducía la capacitación de espermatozoides ovinos in vitro mediante la fosforilación/activación de la MAP quinasa ERK. Esta es la primera referencia sobre la relación entre EGF/EGFR y las dos quinasas, PKA y ERK, en espermatozoide.
Junto con el cAMP, el calcio es otro segundo mensajero esencial para que la capacitación del espermatozoide de mamífero tenga lugar. En este aspecto, se describió por primera vez la presencia en el espermatozoide ovino de la proteína de unión a calcio, calmodulina, a lo largo de todo el flagelo, en postacrosoma, y región ecuatorial, probablemente asociada a estructuras del citoesqueleto o membranas, dada su insolubilidad en detergente. Además, esta proteína participaría en la capacitación, regulando la actividad fosfodiesterasa y, por tanto, la homeostasis del cAMP.
Otro aspecto de la capacitación del espermatozoide ovino estudiado en esta tesis fue la hiperactivación flagelar, demostrándose que este proceso estaba regulado por calcio, pero no por cAMP. También se establecieron unos valores umbral indicativos de hiperactivación flagelar para el espermatozoide ovino en esas condiciones de estudio. Así, se consideró que la hiperactivación tenía lugar cuando % LIN ¿ 45%, y ALH ¿ 3,5 ¿m. También pudo hallarse una correlación entre el porcentaje de espermatozoides reaccionados y los valores VCL y ALH, lo cual sugería que reacción acrosómica e hiperactivación podrían ser regulados por mecanismos comunes. El estudio con el quelante de calcio, BAPTA-AM, reveló que el calcio extracelular sería necesario para la hiperactivación a largo plazo, mientras que el calcio almacenado en reservorios intracelulares sería suficiente para desencadenar la hiperactivación a corto plazo.
Otro aspecto de la capacitación investigado en esta tesis fue el papel del colesterol. En general, la capacitación in vitro del espermatozoide de mamífero requiere de la presencia de un aceptor de colesterol en el medio, dado que la salida de colesterol de la membrana plasmática es un evento necesario para que la capacitación tenga lugar. Sin embargo, en esta tesis se describe que la capacitación in vitro del espermatozoide ovino es independiente de la extracción de colesterol, pues ni la albúmina sérica bovina (BSA) ni las metil-beta-ciclodextrinas (MBCD) fueron capaces de extraer colesterol o inducir la capacitación. Este hecho podría relacionarse con el hecho de que la membrana plasmática del espermatozoide ovino tiene una proporción colesterol:fosfolípidos muy baja, peculiaridad que se relaciona con la elevada susceptibilidad al frío que presenta el esperma de esta especie, y con el tiempo requerido para cpacitarse, que estimamos en aprocimadamente 3 horas. También caracterizamos los rafts lipídicos en el espermatozoide ovino. Consisten en microdominios de membrana plasmática, enriquecidos en colesterol y lípidos saturados, considerados plataformas de señalización celular. Su composición lipídica no se modificó tras la capacitación, corroborando que la capacitación es independiente de la extracción de colesterol. En resumen, en esta tesis se recogen diversos aspectos, no descritos hasta el momento, relacionados con el proceso de capacitación del espermatozoide ovino, poniendo de manifiesto que en esta especie, la capacitación estaría regulada en gran parte de manera diferente a lo descrito para otras especies de mamífero.
