Resumen de Construcción y deconstrucción de la cadena de transporte electrónico mitocondrial
El sistema de fosforilación oxidativa o sistema OXPHOS está formado por cinco complejos multiprotéicos que suman un total de 89 subunidades diferentes. La peculiaridad de este sistema es que sus subunidades se encuentran codificadas en distintos compartimentos celulares, es decir, 13 proteínas se encuentran codificadas en el DNA mitocondrial, mientras que el resto son codificadas en el núcleo. El doble origen genético del sistema OXPHOS implica una comunicación estrecha y muy regulada entre el núcleo y la mitocondria. Así pues, la construcción de la cadena de transporte electrónico mitocondrial, indica el orden y las diversas asociaciones que se han de establecer entre las distintas subunidades para ensamblar los complejos que componen este sistema, con arreglo a las leyes de la naturaleza.
Desde hace más de una década, nuestro laboratorio ha trabajado arduamente en la generación de distintas líneas celulares de ratón mutantes en diversos genes mitocondriales, con el fin inicial de generar modelos animales para el estudio de las enfermedades mitocondriales. La caracterización y el estudio minucioso de cuatro líneas celulares mutantes en tres genes mitocondriales (mt-Nd4, mt-Nd5 y mt-Nd6), han permitido establecer el orden de entrada de las siete subunidades mitocondriales (ND1-6, ND4L) en la ruta de ensamblaje del complejo I. Para ello, se han utilizado técnicas de marcaje radioactivo específico de las subunidades mitocondriales, su seguimiento en la incorporación a los subcomplejos y formación de los complejos respiratorios, mediante técnicas de Blue-Native. Es decir, nuestro trabajo aporta nuevas evidencias de cómo se construye el complejo I en la membrana interna mitocondrial. Un mejor conocimiento de este proceso puede ser útil para entender la base molecular de muchas deficiencias asociadas con alteraciones en dicho complejo. Nuestro trabajo contribuye a solucionar la incógnita, hasta la fecha sin resolver, de cómo se incorporan las subunidades codificadas en el mtDNA en la ruta de ensamblaje del complejo I. De acuerdo con nuestros resultados, las subunidades ND1 y ND2 se incorporan en diferentes módulos de ensamblaje, siendo éstas la primera y la segunda subunidades mitocondriales en incorporarse, respectivamente. La subunidad ND4 es esencial para la maduración del subcomplejo del brazo de membrana, constituyendo ésta la tercera entrada de las subunidades mitocondriales. Sin embargo, la ausencia de ND4, permite el ensamblaje de los intermedios que contienen la subunidad del brazo periférico NDUFS3. Estos resultados argumentan a favor del ensamblaje de un fragmento del brazo periférico que se ancla en la membrana a través de ND1 y es independiente de la mayor parte del brazo de membrana. La subunidad ND6 es necesaria para que los subcomplejos del brazo de membrana y brazo periférico se unan, siendo éste el cuarto punto de entrada de las subunidades mitocondriales. Finalmente, la última en incorporarse sería la subunidad ND5, representado la quinta entrada en la ruta de ensamblaje.
Una vez abordado el estudio del ensamblaje del complejo I de la cadena de transporte electrónico, la siguiente aproximación fue intentar prescindir de la localización mitocondrial de los genes codificados en el mtDNA, para evaluar su aplicabilidad a la terapia de las enfermedades mitocondriales. Lo que dio lugar al primer reto tecnológico abordado en esta tesis, la expresión en el citoplasma de las proteínas codificadas en el mtDNA y su posterior importe a la mitocondria: Expresión Alotópica. Dicha estrategia se enfrenta con dos problemas importantes: el primero es la necesaria recodificación de los genes desde el código genético mitocondrial al universal, y el segundo, más relevante, la alta hidrofobicidad de las proteínas codificadas en el mtDNA que impide su correcto importe a la mitocondria, en la mayoría de los casos evaluados. Nuestro trabajo ha intentado explorar el potencial de esta aproximación experimental mediante la expresión alotópica de mt-Nd6 en una línea celular mutante en dicho gen, generada en nuestro laboratorio. Los resultados obtenidos nos llevan a plantear a la comunidad científica una llamada de atención, en el sentido de extremar la precaución a la hora de interpretar los resultados. Aunque nuestros resultados no se puedan extrapolar directamente a otras mutaciones diferentes, ponen de manifiesto que es necesario realizar una serie de controles que demuestren que el rescate de la función mitocondrial se debe a la proteína expresada alotópicamente, y no a una reversión en la mutación original. Debido a que con menos del 10 % de la secuencia de mt-Nd6 silvestre se ensamblan niveles casi normales de complejo I, tal tasa de reversión no se detecta mediante secuenciación y puede llevar a conclusiones erróneas, si no se realizan los controles adecuados.
Aunque la función más conocida de la mitocondria es la generación de ATP a través de la fosforilación oxidativa, el sistema OXPHOS lo podemos deconstruir en 3 procesos fundamentales: El primero es la transferencia de electrones desde el NADH o el FADH2 hasta el O2 para producir H2O, realizado por la cadena de transporte electrónico mitocondrial (Complejos I, II, III y IV). Durante este proceso, algunos electrones pueden desviarse de su ruta, reaccionando directamente con el O2 dando lugar a especies reactivas de oxígeno (ROS). La energía que se libera en la transferencia de electrones sirve para llevar a cabo el segundo de los procesos del sistema OXPHOS: el bombeo de protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana a través de los complejos I, III y IV, dando lugar a la fuerza protón-motriz (proton motriz force PMF), crucial para la síntesis de ATP (tercer proceso del sistema OXPHOS), pero también necesaria para realizar una gran variedad de procesos dependientes de energía. Estos procesos dependen del potencial de membrana o del gradiente de H+. Por ejemplo, la entrada de Ca2+, el intercambio ATP/ADP mediante la nucleótido de adenina translocasa (ANT), el flujo de Na+ y K+ a través de la membrana interna mitocondrial y el importe de precursores protéicos . Sin embargo, los antiportes mitocondriales (aspartato/glutamato, H+/K+, H+/Na+, 2H+/Ca2+) y los simportes (H+/piruvato y Pi/ADP) son dependientes de la variación de pH. El tercer proceso del sistema OXPHOS consiste en utilizar la energía electroquímica, inherente a la diferencia en concentración de protones y a la separación de cargas a través de la membrana interna mitocondrial, para impulsar la síntesis de ATP conforme los protones fluyen a favor de gradiente de vuelta hacia la matriz a través de la ATP sintasa o complejo V.
La transferencia de electrones y la síntesis de ATP están acopladas en mitocondrias sanas. Existen ciertas situaciones fisiológicas en las que este acoplamiento se modifica de forma controlada. El gradiente electroquímico generado entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana puede disiparse en forma de calor, a través de las proteínas UCP (uncoupling protein), proceso fundamental en la termorregulación de los mamíferos y otros seres vivos. El desacoplamiento entre la transferencia de electrones y la síntesis de ATP es un fenómeno que se produce en la naturaleza no sólo en la termorregulación, sino también mediante enzimas alternativas al paso de electrones como la NADH deshidrogenasa alternativa (NDI1) y la oxidasa alternativa (AOX) que se encuentran presentes hongos, plantas y animales inferiores, coexistiendo incluso con la cadena de transporte electrónico como es el caso de la levadura Yarrowia lipolytica .
Uno de los objetivos de este trabajo ha sido el análisis de los elementos que constituyen el sistema OXPHOS, y en concreto la cadena de transporte electrónico mitocondrial y sus funciones. Para ello, hemos realizado el diseño de sistemas in vivo para entender cada uno de los procesos de la cadena y para responder por qué en mamíferos este sistema se encuentra integrado y cuál de dichos procesos es crítico en diferentes situaciones. Para ello tuvimos que desarrollar el segundo reto tecnológico de esta tesis: La xenoexpresión (xeno- significa extranjero, expresión de una proteína de un organismo en otro) de enzimas alternativos del sistema OXPHOS.
Hemos deconstruido la cadena de transporte electrónico parcialmente, es decir, la hemos analizado tomando como eje clave en el estudio uno de los transportadores móviles de electrones: la ubiquinona. Así hemos dividido la cadena en dos partes: reducción y oxidación de la ubiquinona.
Nuestras líneas celulares mutantes en complejo I, cuya mutación impide el ensamblaje del mismo, nos ofrecen el modelo de estudio ideal para este análisis. La ubiquinona no puede ser reducida por el complejo I, solamente puede ser oxidada por la acción combinada de los complejos III y IV. . La enzima monopeptídica NDI1 de Saccharomyces cerevisiae, capta los electrones del NADH y los cede a la ubiquinona aunque sin bombear protones al espacio intermembrana, es decir, es capaz de cumplir parcialmente la función del complejo I (formado por 45 subunidades en mamíferos). De hecho, algunos autores la proponen como molécula terapéutica en deficiencias en complejo I.
En este trabajo hemos confirmado que la expresión de NDI1 en líneas celulares de ratón mutantes en complejo I, es capaz de restaurar la oxidación del NADH. De hecho, nuestras líneas celulares que expresan la enzima de levadura: ND6KONDI1 y ND4KONDI1, sobreviven indefinidamente en un medio no fermentable, a diferencia de lo observado por otros autores, que sólo demuestran supervivencia durante 10 días. Esto se debe a la correcta integración de la proteína con el resto de los complejos de la cadena y al bombeo de protones a través de los complejos III y IV, necesario para la síntesis de ATP por el complejo V.
Por otra parte, las líneas celulares mutantes en complejo III o IV no son capaces de oxidar la ubiquinona, siendo idóneas como modelo para deconstruir la segunda parte de la cadena. Como consecuencia de la incapacidad para oxidar la ubiquinona, dichas líneas celulares sólo pueden mantenerse en cultivo tras la adición de uridina al medio de cultivo. En nuestro trabajo hemos demostrado, cómo en presencia de una enzima monopeptídica de hongos, plantas y animales inferiores, denominada oxidasa alternativa (AOX), las células carentes de complejo III o IV son capaces se sobrevivir en ausencia de uridina. Esta enzima es capaz de transferir los electrones desde CoQ al oxígeno, sustituyendo así la acción combinada de los complejos III y IV, y permitiendo el correcto funcionamiento de la enzima dihidroorotato deshidrogenasa, implicada en la síntesis de pirimidinas. Una característica fundamental de AOX es su incapacidad para bombear protones al espacio intermembrana, por tanto la energía que se produce en la transferencia de electrones se disipa en forma de calor, característica que le sirve para cumplir una de sus principales funciones en plantas: la regulación de la termogénesis. Hemos comprobado que dicha enzima no resulta tóxica expresada en células control de ratón, confirmando los resultados obtenidos previamente por otros autores, en células humanas sanas en cultivo.
En 2004, nuestro grupo demostró que en ausencia del complejo III, el complejo I se ensambla pero es inestable . Este fenómeno fue nuevamente observado por el grupo del Dr. Carlos Moraes, en líneas celulares de ratón carentes de complejo IV. Ambos trabajos sugieren que la inestabilidad del complejo I es una consecuencia de la ausencia física del complejo III ó del complejo IV.
Para nuestra sorpresa, la expresión de AOX estabiliza el complejo I, en ausencia de complejo III o complejo IV, en células de mamífero. En nuestra opinión, hay dos posibles explicaciones a este hecho: primera, la existencia de una interacción física entre el complejo I y AOX (similar a la que pudiera existir entre complejo I y III); o segunda, que sea la oxidación de la ubiquinona por AOX la que permita la estabilidad y la correcta función del complejo I.
La demostración de una posible interacción entre complejo I y AOX ha sido abordada usando distintas aproximaciones: detección de AOX en geles de Blue Native mediante Western blot, immunoprecipitación del complejo I a partir de mitocondrias digitonizadas e inmunodetección. La última técnica utilizada en colaboración con el servicio de Proteómica del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), ha sido el análisis masivo de todas las proteínas que migran en el complejo I estabilizado y el supercomplejo nuevo que se forma en la línea celular CYTBKOAOX. Para ello se llevó a cabo una cromatografía líquida acoplada a un espectrómetro de masas, desafortunadamente no se encontró ningún péptido correspondiente a AOX en ninguna de las dos bandas. Por tanto, la posible interacción física entre complejo I y AOX, que en un principio parecía ser la explicación más plausible, no ha podido ser demostrada. Estos resultados confieren a la segunda hipótesis un mayor peso en nuestro modelo.
La acumulación de ubiquinona reducida puede aumentar el daño oxidativo en la mitocondria. La producción de radicales libres de oxígeno (O2-) en las inmediaciones del complejo I puede desencadenar su inestabilidad y posterior degradación. La expresión de AOX al oxidar la ubiquinona, impide que esto se lleve a cabo, estabilizando el complejo. Por tanto, en condiciones de baja concentración de oxígeno, la cantidad de O2 disponible para producir ROS disminuirá, reduciendo así el daño oxidativo estabilizando el complejo I. Este trabajo muestra resultados preliminares de dicha hipótesis, realizados en colaboración con el grupo del Dr. Antonio Martínez del Hospital La Princesa de Madrid. En condiciones de 1% de oxígeno, volvemos a tener el complejo I estable en ausencia de complejo III, IV, sugiriendo que puede ser del daño auto-oxidativo a nivel de complejo I el responsable de la inestabilidad del mismo, arrojando nuevos indicios sobre la dependencia entre los complejos del sistema OXPHOS.
Los mutantes en complejo III y IV, gracias a la expresión de AOX, restauran la actividad del complejo I, pero el bombeo de protones mediante sólo éste complejo, no es suficiente para alcanzar una fuerza protón motriz que permita a las células vivir indefinidamente en un medio no fermentable, muriendo al cabo de 2-3 días. Aquí encontramos una diferencia con lo sucedido en los mutantes en complejo I, donde gracias a la expresión de NDI1 las células son capaces de vivir en dicho medio, debido a la recuperación de la oxidación del NADH dentro de la mitocondria y al bombeo de protones a través de los complejos III y IV.
La deconstrucción total de la cadena de transporte electrónico mitocondrial supone el principal reto biológico afrontado en este trabajo. Mediante la xenoexpresión de las enzimas alternativas NDI1 y AOX en células de ratón carentes de mtDNA (¿º), hemos sido capaces de separar el transporte de electrones del bombeo de protones (y por tanto de la síntesis de ATP).
En este trabajo hemos podido recuperar el flujo de electrones en la membrana interna de la mitocondria y restaurar así las actividades metabólicas que de él dependen. Dicho trabajo, nos ha permitido demostrar que la oxidación de la ubiquinona por AOX es suficiente para recuperar la actividad de la succinato deshidrogenasa del ciclo de Krebs, la lanzadera del glicerol 3-P, la EFT del metabolismo de ácidos grasos y dihidroorotato deshidrogenasa en la síntesis de pirimidinas, convirtiendo a la células en protótrofas para el piruvato y la uridina. La ventaja que confiere la expresión de NDI1 en las células ¿ºNDI1/AOX se pone de manifiesto al tratar las células con un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa kinasa (DCA, inhibidor del reciclaje del NAD+ por la fermentación láctica). De este modo la obtención de NAD+ dentro de la mitocondria, vía NDI1, es crítica para la supervivencia celular.
Tanto las células ¿ºAOX como las ¿ºNDI1/AOX respiran, aunque dicha respiración es sustancialmente menor que la respiración endógena observada en una línea celular control. Mediante la expresión de otras NADH alternativas como la NADH-Q oxidoreductasa externa de Saccharomyces cerevisiae, localizada en el espacio intermembrana, capaz de captar los electrones del NADH citosólico cediéndolos a la ubiquinona, podríamos aumentar el flujo de electrones y como consecuencia la respiración celular. Aunque las células ¿ºNDI1/AOX han recuperado el transporte de electrones desde el NADH hasta el oxígeno, son incapaces de vivir en un medio no fermentable, debido a que no pueden ensamblar el complejo V ya que carecen de dos subunidades mitocondriales (ATPasa6 y ATPasa8) y además dichas enzimas alternativas no bombean protones al espacio intermembrana. Se ha demostrado que es posible restaurar la mayor parte del estrés metabólico inducido en la células por daño en el sistema OXPHOS, indicando que dicho estrés se debe más a la alteración producida por un desequilibrio en el flujo de óxido-reducción de la ubiquinona, que a la pérdida de la capacidad de la síntesis de ATP mitocondrial.
El análisis completo de todos los elementos que forman el sistema OXPHOS, se llevará a cabo cuando podamos estudiar el bombeo de protones independiente del transporte de electrones y la recuperación de la síntesis de ATP en ausencia de cadena.
