Trampas de genes para la caracterización de proteínas de localización mitocondrial
- Autores: Elena de Tomás Mateo
- Directores de la Tesis: Maria Pilar Bayona-Bafaluy (dir. tes.), José Antonio Enríquez Domínguez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Elena Hidalgo Hernando (presid.), Erika María Fernández Vizarra Bailey (secret.), Jose Antonio Ainsa Claver (voc.), María F. Fillat (voc.), Miguel Torres Sánchez (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Las mitocondrias de mamíferos son orgánulos esenciales para la supervivencia celular cuya función principal es la generación de energía a través de la fosforilación oxidativa. Sin embargo, en ellas también se llevan a cabo reacciones bioquímicas esenciales para la célula tales como el ciclo de Krebs, reacciones del metabolismo de los aminoácidos y ácidos grasos, el ciclo de la urea, la biosíntesis del grupo hemo, biosíntesis de clusters sufoférricos, generación de cuerpos cetónicos y la síntesis de hormonas.
La cadena respiratoria mitocondrial está compuesta por, aproximadamente 100 proteínas diferentes, de las cuales solamente 13 se encuentran codificadas en el mtDNA; el resto están codificadas por genes nucleares. De hecho, se estima que varios cientos de genes nucleares son necesarios para completar el sistema de fosforilación oxidativa funcional.
El doble origen genético del sistema OXPHOS implica una comunicación continua y estrechamente regulada entre la mitocondria y el núcleo donde además de los componentes estructurales, existe un amplio número de proteínas codificadas en el DNA nuclear implicadas en el ensamblaje y mantenimiento de los complejos respiratorios. Además, en el DNA nuclear se codifica un gran número de proteínas no necesariamente relacionadas directamente con el ensamblaje del sistema OXPHOS ni con el mantenimiento del mtDNA, pero que pueden interactuar con estos componentes. Entre estas proteínas encontramos proteasas, antioxidantes, diferentes transportadores, proteínas implicadas en la herencia, en las características morfológicas mitocondriales ó en la inducción de la apoptosis.
Aunque el número de proteínas mitocondriales de mamífero no se conoce con exactitud, se estima que está constituido por entre 1100-1400 proteínas distintas. Identificar el número total de proteínas que forman la mitocondria y entender cómo se integran en las diferentes vías, constituye uno de los mayores objetivos de la biología celular. Recientemente se ha publicado el catálogo más completo de genes mitocondriales jamás descrito (MitoCarta) (Pagliarini, Calvo et al. 2008). Este compendio ha recopilado un total de 1098 proteínas mitocondriales en una base de datos de libre acceso donde cada proteína ha sido determinada como mitocondrial por la integración de los datos obtenidos por varios métodos: espectrometría de masas, microscopía, predicción bioinformática de señales de direccionamiento a mitocondria ó estudios de homología de secuencias.
Como alternativa a estos estudios proteómicos donde no se da ninguna información acerca de su ontología genética y con el objetivo de disponer de una colección de genes nucleares de localización mitocondrial considerablemente más amplia, exponemos un método basado en la mutagénesis a gran escala de genes nucleares con un vector de captura de genes.
Para ello hemos diseñado un sistema de genética combinatoria que aprovecha la posibilidad de obtener eventos aleatorios de inserción en el genoma con un vector diseñado para la captura de genes, junto con un sistema de selección positiva.
Por otro parte, en nuestro grupo existe un gran interés en desarrollar diferentes estrategias de terapia génica como posible tratamiento de desórdenes asociados con mutaciones en el mtDNA. Como alternativa se ha propuesto la posibilidad de expresar los genes codificados por el mtDNA por los ribosomas citoplasmáticos y su posterior importe a la mitocondria donde sustituiría a la proteína mutada (expresión alotópica).
En este trabajo proponemos una estrategia alternativa para la expresión alotópica de los genes mitocondriales MT-ND4 y MT-CYB usando vectores de captura de genes. Al mutagenizar las líneas celulares ND4KO y CYBKOf con estos vectores, la selección metabólica facilitará seleccionar los clones en los que una secuencia de direccionamiento mitocondrial permite la expresión alotópica de ND4 ó CYB y por consiguiente la restauración de la función OXPHOS. Este sistema permite probar todas las secuencias de direccionamiento mitocondrial del genoma hasta su saturación. Además, la proteína de fusión que se produce, podría facilitar el importe de la subunidad mitocondrial que se desea expresar.
Dentro de este contexto general basado en el desarrollo de herramientas de captura de genes se presenta la siguiente tesis, cuyos objetivos principales se desglosan a continuación:
1. Identificar nuevos genes nucleares de localización mitocondrial utilizando vectores de captura de genes (AOX/COX10).
a) Diseño y generación de los vectores de captura de genes pXGT.AOXnsp y pXGT.COX10nsp que permitan la captura de proteínas de localización mt por inserción al azar. Estos vectores contienen el sitio aceptor de procesamiento de la proteína de ratón En2 asociada con una proteína de rescate, la oxidasa alternativa (AOX) ó la farnesil transferasa de complejo CIV (COX10).
b) Producción de partículas virales con alta eficiencia de transducción que contengan nuestro vector de GT. Para este proceso utilizamos los vectores lentivirales de segunda generación proporcionados por el Dr. Trono de la Universidad de Lausanne.
c) Realización de ensayos masivos de interrupción aleatoria de genes mediante la transfección de la línea receptora adecuada con las partículas lentivirales. Selección metabólica y aislamiento de los clones.
d) Identificación del gen capturado por PCR ¿Splinkerette¿. Secuenciación y búsqueda en la base de datos de ¿Ensembl Mouse¿ para acceder a la información disponible sobre el ¿locus¿ génico.
e) Creación de una base de datos que recopile la información referente a la posición de inserción en el genoma, el cromosoma, el gen, el intrón, el marco de lectura del exón anterior y el número de exones.
2. Utilizar vectores de captura de genes para expresar de forma alotópica las proteínas ND4 y CYB.
a) Diseño y construcción de un vector de captura de genes que contenga los genes mitocondriales MT-ND4 y MT-CYB recodificados para su expresión en el compartimento nuclear-citoplasmático.
b) Transfección de la línea celular ND4KO ó CYBKOf para realizar una búsqueda a gran escala entre las secuencias de direccionamiento mitocondriales del genoma para determinar si alguna es capaz de importar ND4 ó CYB a la mitocondria.
c) Diseño de una construcción control que contiene la región menos hidrofóbica de ND4 para validar el potencial de nuestro vector de atrapar señales de direccionamiento mitocondrial.
