Resumen de Organización modular de la cadena respiratoria de mamíferos y optogenética mitocondrial
La síntesis de ATP en células eucariotas tiene lugar predominantemente en las mitocondrias, a través del proceso de fosforilación oxidativa (OXPHOS). En este proceso intervienen cinco complejos enzimáticos ubicados en la membrana mitocondrial interna: NADH deshidrogenasa (complejo I), succinato deshidrogenasa (complejo II), Ubiquinol-citocromo c oxidorreductasa (complejo III), citocromo c oxidasa (complejo IV) y F0F1- ATPsintasa. Gracias a ellos se acopla el transporte electrónico a la síntesis de ATP utilizando el gradiente electroquímico generado por la translocación de protones al espacio intermembrana. Aunque se ha logrado identificar todas las subunidades proteicas que forman parte de los complejos, trece de las cuales están codificadas en el DNA mitocondrial (mtDNA) y el resto en el DNA nuclear, aún se desconocen muchos detalles sobre la biogénesis y organización del sistema OXPHOS.
El DNA mitocondrial de mamíferos presenta una gran variabilidad como consecuencia de mutaciones puntuales debidas, entre otros, a factores ambientales. El catálogo de mutaciones puntuales y deleciones del DNA mitocondrial que causan enfermedades humanas es muy amplio y continúa creciendo a un ritmo acelerado (MITOMAP, http://www.mitomap.org). Estas mutaciones están asociadas a un variado espectro de manifestaciones clínicas, mayoritariamente disfunciones neurológicas degenerativas, que hasta la fecha no tienen tratamiento efectivo. Por otra parte, los defectos en el mtDNA también provocan síndromes asociados a otros órganos, debilidad muscular, fallo cardíaco, diabetes, disfunciones renales, enfermedad hepática, epilepsia mioclónica, etc. Desde el punto de vista bioquímico, las mutaciones del mtDNA pueden afectar a la función de uno o más complejos respiratorios, aunque a menudo su determinación precisa resulta difícil.
En los últimos años se han producido avances significativos en el conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la biogénesis del sistema OXPHOS. Sin embargo, quedan todavía algunas cuestiones abiertas sobre la interacción física y funcional de los diferentes elementos que componen el sistema, en situaciones fisiológicas y patológicas.
En esta tesis doctoral se han abordado dos problemas relacionados con el estudio estructural y funcional de este sistema: A) Supercomplejos respiratorios: factores implicados en su construcción y gestión de los transportadores móviles.
Dos modelos explican la disposición de los complejos en la membrana mitocondrial. El primero, conocido como "modelo fluido", propone que los complejos están libres en la membrana interna y que el transporte electrónico entre ellos es posible gracias a la libre difusión de dos transportadores móviles de electrones (ubiquinona o CoQ y cit c). El segundo, "modelo sólido", propone que esos complejos se asocian entre sí formando estructuras supramoleculares llamadas supercomplejos. Se han descrito supercomplejos en bacterias y en mitocondrias de levadura, plantas y mamíferos. Sin embargo, hasta la fecha se desconocen los factores implicados en el ensamblaje de supercomplejos, a excepción del papel de la cardiolipina. Tampoco se tienen datos experimentales acerca de las implicaciones del ensamblaje en supercomplejos en el flujo de electrones, en la gestión de los transportadores móviles o en la creación de especies reactivas.
Nuestro trabajo en esta tesis ha permitido identificar una proteína en mamíferos indispensable en la interacción entre los complejos respiratorios III y IV, así como dilucidar la existencia de vías independientes para el paso de electrones, a través de "pooles" de CoQ dedicados específicamente a la transferencia entre CI y CIII, o bien entre CII y CIII.
B) Restauración del bombeo protónico mediante una estrategia optogenética.
En el sistema OXPHOS convergen una serie de procesos estrechamente relacionados, como son la oxidación y reducción de sustratos, el transporte electrónico, bombeo de protones y generación de gradiente electroquímico, síntesis de ATP, desvío electrónico hacia la generación de especies reactivas, etc.
Para poder comprender mejor las relaciones establecidas y el diferente grado de implicación de los elementos del sistema sobre otras rutas metabólicas asociadas, nuestro grupo ha propuesto una estrategia que permite desglosar cadena transportadora de electrones (CTE) y la síntesis de ATP.Anteriormente nuestro grupo logró restaurar en líneas celulares murinas carentes de mtDNA, y por tanto de sistema OXPHOS, el flujo de electrones desde el NADH hasta el oxígeno mediante la xenoexpresión de dos proteínas: NDI1 (NADH deshidrogenasa monomérica de levadura, Saccharomyces cerevisiae) y AOX (Oxidasa alternativa de Emericella nidulans). La recuperación del flujo de electrones permitió la recuperación de otras vías metabólicas relacionadas, como la biosíntesis de pirimidinas o la G3PDH. Sin embargo ni NDI1 ni AOX permiten el bombeo de protones a través de la membrana interna mitocondrial necesario para la síntesis de ATP, entre otros procesos.
En el desarrollo de esta tesis se han llevado a cabo diversas estrategias de aplicación de la optogenética con el fin de lograr un bombeo de protones en la MIM, independiente del que ejerce la cadena respiratoria.
Las conclusiones que podemos extraer del trabajo realizado en esta tesis doctoral son:
- Que existen vías alternativas para el flujo de electrones dependiendo de su procedencia, como consecuencia de la organización de los complejos respiratorios en supercomplejos.
- Que ante niveles reducidos de ensamblaje de CIII, éste preferentemente se asocia a CI en supercomplejos. Esto puede desencadenar una disminución del flujo electrónico a través de de CII.
- Hemos identificado la primera proteína de mamíferos involucrada en la interacción entre complejos respiratorios. Dicha proteína, Cox7a2l, es esencial en la asociación entre CIII y CIV, y se encuentra formando parte estructural del supercomplejo.
- La cepa de ratón C57BL/6 es portadora de una mutación en el gen de Cox7a2l, y es incapaz de ensamblar supercomplejos que contengan III y IV.
-Pese a la variedad de estrategias empleadas, no hemos logrado desarrollar una estrategia de optogenética que nos permita ejercer un bombeo protónico a través de la membrana interna mitocondrial de manera artificial, por lo que se requiere continuar trabajando para conseguir tal fin.
