Resumen de Mecanismos catalíticos en ferredoxina-nadp+ reductasas de tipo planta
Las proteínas pertenecientes a la familia FNR de tipo planta comparten una estructura tridimensional similar, y un origen evolutivo común. A pesar de eso, las homologías de secuencia entre FNRs de los diferentes subgrupos de la familia son muy diversas, como también lo son las funciones biológicas que desempeñan (Ceccarelli et al. 2004; Aliverti et al. 2008). Esto se traduce en propiedades de óxido-reducción, afinidad por los sustratos, velocidad de los procesos de TH y TE, y eficiencia catalítica global muy variables. Una primera clasificación general agrupa a las FNRs de tipo planta en FNRs plastídicas y FPRs bacterianas (Arakaki et al. 1997). Sin embargo, las reductasas de ambos grupos también presentan una serie de diferencias más o menos sutiles, por lo que es conveniente prestar atención a las características específicas de cada una. De esta forma, una clasificación más estricta las subdivide en FNRs plastídicas de cianobacterias, hoja de planta, raíz de planta, apicoplastos, y Leptospira; y FPRs de clases Ia, Ib y II. Las mayores diferencias entre ellas se encuentran en la conformación que adopta la flavina dentro de la proteína y en la secuencia de aminoácidos del extremo carboxilo terminal.
En la presente tesis se han analizado las diferencias existentes entre diversas FNRs plastídicas y bacterianas en términos de velocidad y mecanismo de TH y propiedades de óxido-reducción. Dentro de este estudio, se ha caracterizado por primera vez mediante técnicas de mezcla rápida con flujo detenido acoplado a un detector de diodos la reacción de TH entre NADP+/H y las FNRs nativas de hoja de guisante (PsFNR) y L. interrogans (LiFNR), y las FPRs de E. coli (EcFPR, clase II) y X. axonopodis pv. citri (XaFPR, clase Ia). Estos análisis han permitido llevar a cabo una evaluación global del proceso tanto en velocidad de TH como en formación de especies intermedias como ya se había realizado anteriormente en la enzima de Anabaena (AnFNR) (Tejero et al. 2007). De forma paralela, el estudio comparativo de los procesos de transferencia de dos isótopos de hidrógeno tanto en estas proteínas nativas, como en mutantes de AnFNR y PsFNR, ha permitido evaluar la contribución de procesos cuánticos a la TH y establecer, por primera vez, una relación entre evolución y dinámica de los sitios activos en una familia de flavo-reductasas. Además, se ha evaluado más exhaustivamente la implicación del residuo alifático que empareda a la isoaloxacina y de la extensión C-terminal presentes en RcFPR. El análisis comparativo de reductasas nativas se ha completado mediante la determinación de los valores de potencial de óxido reducción de PsFNR y LiFNR.
Por otro lado, se ha abordado el estudio del efecto de la sustitución de diversos residuos conservados situados bien en el sitio activo, o bien en las regiones de unión a flavina y piridín nucleótido en AnFNR y PsFNR. Las mutaciones o modificaciones se diseñaron racionalmente a partir de conocimientos previos acerca de estas proteínas, con la intención de analizar el papel que desempeñan residuos concretos, o modificar algunas de las propiedades de la enzima. Cada una de las zonas o residuos investigados demostraron tener implicación en más de un proceso relacionado con la catálisis, remarcando la complejidad de los factores que gobiernan las propiedades catalíticas de estas proteínas. A pesar de que algunas de las posiciones estudiadas en Anabaena ya habían sido tratadas en otras reductasas de plantas superiores, nuestros resultados se han mostrado algo diferentes, lo que obedece a un mecanismo adaptativo de cada clase de reductasas que invita, una vez más, a considerarlas como grupos diferenciados.
A continuación se pondrán en conjunto los conocimientos adquiridos en relación a los puntos clave del proceso catalítico catalizado por ferredoxina-NADP+ reductasas de tipo planta, haciendo hincapié en las diferencias que presenta cada subgrupo.
1. Propiedades de la flavina La molécula de flavina es la responsable de la función catalítica de la FNR. Dentro del entorno proteico, tanto su disposición espacial como sus propiedades electrónicas difieren de las del FAD libre en solución. Se ha observado una correlación entre estas dos características, por lo que tanto las conexiones del anillo de isoaloxacina con la cadena polipeptídica, como las establecidas por las partes no reactivas del cofactor condicionan en gran medida las cualidades físico-químicas de las FNRs.
1.1. Determinantes de la conformación y plegamiento del FAD La molécula de flavina se ha encontrado dentro de las holo-FNRs adoptando tres conformaciones diferentes: plegada en FPRs de ambas clases, extendida en FNRs fotosintéticas de hoja de planta y de cianobacterias, y aún más extendida en FNRs plastídicas que funcionan en la dirección no fotosintética como las de hoja de raíz, LiFNR y PfFNR. En todas las FNRs plastídicas la porción no reactiva de la flavina se acomoda en un bucle conservado del dominio de unión a FAD, mientras que en FPRs ese bucle está ausente, y las interacciones de la parte adenina se dan con residuos del otro dominio estructural. Además, la comparación de secuencia y estructura entre FNRs fotosintéticas y reductasas NAD-dependientes de su familia estructural, muestra que en estas últimas la flavina también se encuentra más plegada. Bajo la premisa de que las conexiones establecidas por su parte adenina debían ser fundamentales para la determinación estructural de la molécula de FAD y, por extensión, de sus propiedades físico-químicas, se analizó el efecto de dos modificaciones: 1) la eliminación de la extensión C-terminal de RcFPR, y 2) la modelación del bucle de unión a adenina de AnFNR, diseñada con objeto de emular el plegamiento que presenta la molécula de flavina en reductasas NAD-dependientes. Sorprendentemente, ninguna de estas dos aproximaciones resultó en cambios en la disposición espacial del FAD, como muestran las estructuras cristalográficas resueltas. Ese mismo resultado se ha observado recientemente en una proteína quimera entre PsFNR y EcFPR (Musumeci et al. 2011). De estos resultados se concluye que la conformación de la flavina dentro de las FNRs está condicionada por otras regiones de la proteína diferentes a los residuos que acomodan a la adenina.
1.2. Propiedades electrónicas de la flavina Accesibilidad del anillo de isoaloxacina. La parte reactiva del cofactor está enterrada dentro de las FNRs, lo que se traduce en unas características de absorción y fluorescencia diferentes a las de la flavina libre, y que además son muy similares entre las enzimas plastídicas. Por tanto, modificaciones de esas propiedades tras la introducción de mutaciones en la cadena polipeptídica permiten evaluar el alcance de sus efectos en lo que respecta a la unión del cofactor. La variante S80A AnFNR presentó un espectro de absorción en la zona del visible muy alterado respecto al de la enzima nativa, lo que indica que la mutación causa una perturbación importante en el entorno de la flavina, que llega a ser tan fuerte en la variante de espinaca que la producción de esa variante no pudo ser conseguida (Aliverti et al. 1995). El entorno proteico también provoca un cambio en las propiedades electrónicas del FAD, lo que hace que disminuya su valor de coeficiente de extinción. En RcFPR, que no tiene residuo aromático emparedando a la flavina por su cara re, el valor de coeficiente de extinción es similar al del FAD libre. En cambio, la mutación de la Ala266 por una Tyr acercó los valores a los que presentan las enzimas plastídicas. Además, la accesibilidad de la molécula de oxígeno a la isoaloxacina también es diferente, especialmente en la variante de L. interrogans, que en presencia de oxígeno molecular provoca una estabilización de más del 90% de la forma semiquinona.
Modulación del potencial de óxido-reducción. La determinación de los valores de potencial de óxido-reducción de FNRs de L. interrogans, Anabaena y guisante, además de las observaciones experimentales de equilibrio en las reacciones de TH desde NADPH, han permitido señalar algunos factores clave para la modulación de las propiedades de óxido-reducción de la flavina. El valor obtenido para PsFNR fue muy similar al de las variantes de Anabaena y espinaca (Corrado et al. 1996; Nogués et al. 2004a), mientras que el calculado para LiFPR resultó menos negativo, y parecido a los valores reportados para PfFNR y hoja de maíz (Aliverti et al. 2001; Balconi et al. 2009). Esto demuestra una correlación entre potencial de óxido-reducción y disposición espacial de la flavina, que además responde a un mecanismo de adaptación a la dirección de reacción que cataliza mayoritariamente cada reductasa.
El análisis del potencial de óxido-reducción de la flavina en proteínas mutantes de AnFNR y PsFNR mostró además una fuerte modulación del mismo por residuos situados en el sitio activo: Ser59, Tyr79, Ser80, Cys261 (Cys266 en PsFNR), como también se había observado para Glu301 y Tyr303 (Faro et al. 2002a; Nogués et al. 2004a). El resultado de la sustitución de Tyr79 por Phe es especialmente llamativo, ya que mientras en Anabaena la eliminación del puente de hidrógeno que forma este residuo con el ribitil del FAD mostró implicaciones casi exclusivamente en la modulación de Em, la misma variante en la enzima de guisante condujo a una notable disminución de la eficiencia catalítica y la afinidad por el coenzima, indicando una mayor relevancia de su grupo hidroxilo en la regulación de las propiedades catalíticas (Arakaki et al. 2001).
Modulación de la estabilización de FADsq. El entorno proteico favorece la estabilización de la forma semiquinona de la flavina no solo facilitando la separación de los valores de Eox/sq y Esq/hq respecto a los del FAD libre, sino garantizando una distribución de enlaces con la isoaloxacina adecuada para estabilizar la forma semiquinona neutra. Estudios previos habían confirmado una ausencia de estabilización de FADsq en E301A y Y303S AnFNR, así como en S96V en espinaca (Aliverti et al. 1995; Faro et al. 2002a; Nogués et al. 2004a). Aquí se ha conseguido producir y caracterizar la variante S80A AnFNR, que elimina la conexión por puente de hidrógeno con la flavina sin imponer constricciones estéricas adicionales, y que en la variante de espinaca resultaba fuertemente inestable. Se ha confirmado el papel del carboxilo de Ser80 para la formación de FADsq, lo que hace que se vea prácticamente impedida su reacción de TE con Fd. Además la mutación de C266A en PsFNR provocó un aumento del porcentaje de semiquinona estabilizada durante los procesos de fotorreducción y reoxidación, probablemente debido a un efecto indirecto por cambios en Glu306 (Glu301 en AnFNR). La diferente conformación de Glu301 tras la mutación de C266A parece que le hace más propenso a estabilizar FADsq durante la reacción de HT con NADPH para esa variante, como también se ha observado en otras flavoproteínas (McLean et al. 2003; Sabri et al. 2009). Estos resultados confirman la importancia del establecimiento de una adecuada red de puentes de hidrógeno entre el N5i de la flavina y S80, E301 y Y303, tanto en la modulación de Em como en la estabilización de la forma semiquinona.
El entorno de la isoaloxacina en FPRs bacterianas es algo diferente. La conformación plagada de la flavina permite la formación de un enlace por puente de hidrógeno intramolecular entre la amina de la adenina y N1i de la isoaloxacina. Además, presenta una molécula de H2O adicional en el sitio activo participando en la red de puentes de hidrógeno entre los residuos conservados, lo que parece garantizar unas propiedades de óxido-reducción y geometría del sitio activo adecuados para esas reductasas. Los resultados de la incorporación de un residuo de tirosina en la cara re de la isoaloxacina, además de alterar las propiedades de absorción de la flavina, provocó una desestabilización completa de la forma semiquinona, al igual que sucede tras la eliminación de la tirosina C-terminal en Anabaena y guisante (Nogués et al. 2004a). Además, la eliminación de la extensión C-terminal de RcFPR condujo a la estabilización de FADsq aniónica, característica de enzimas con función deshidrogenasa/oxidasa que, al igual que RcFPR, y a diferencia de las FNRs plastídicas, presentan un puente de hidrógeno en posición N1i, en ese caso con la cadena polipeptídica.
2. Unión y TE con Fd Las FNRs son altamente específicas para NADP+ frente a NAD+, pero muy promiscuas con respecto al sustrato proteico. Son capaces de interaccionar y catalizar TE con dos tipos de proteínas muy diferentes: Fds y Flds, y además intercambian in vitro proteínas de distintos organismos (Jenkins et al. 1997; Faro et al. 2003). A pesar de eso, se ha observado que existe una cierta especialización en las FNRs de forma que se ha optimizado su interacción con la Fd con la que debe intercambiar electrones fisiológicamente. Además de modular las características electrónicas de la flavina, mutaciones en el dominio de unión a FAD situadas en la proximidad del cofactor tienen su mayor implicación en los procesos de reconocimiento e interacción con las parejas proteicas. La posición Ser59 queda situada en la cara si de la isoaloxacina, cercana a la interfaz del complejo FNR:Fd. Su sustitución por Ala sugiere un papel de este residuo conservado en la formación de un complejo productivo FNR:Fd mediante la modulación de las interacciones electrostáticas que regulan el acoplamiento final de sus centros redox. Los resultados obtenidos tras la modificación del bucle que acomoda a la adenina muestran sin embargo un papel del mismo durante la primera fase de formación del complejo. Esto apunta a que la función principal de ese bucle es proporcionar los sitios de reconocimiento para Fd y Fld y dotar a la proteína de la flexibilidad necesaria para facilitar su acoplamiento y posterior reorganización de forma que los centros redox de ambas proteínas queden enfrentados de forma adecuada.
Además, esa zona presenta una baja homología entre FNRs fotosintéticas y las variantes PfFNR y LiFNR, enzimas que han divergido del resto de las FNRs de forma que se ha optimizado su interacción con otro tipo de Fds. La regulación de las superficies de interacción entre proteínas tiene como consecuencia un comportamiento diferente ante la presencia de potenciales inhibidores. Aún mayores son las diferencias entre FNRs plastídicas y PFRs bacterianas, que carecen del bucle de unión a adenina. En estas últimas se sugiere que el reconocimiento de sus parejas proteicas está condicionado por la extensión C-terminal (Musumeci et al. 2011).
3. El proceso de unión a NADP+/H 3.1. Pasos del reconocimiento Los datos estructurales de diversos complejos AnFNR:NADP+ habían permitido establecer un modelo de unión secuencial en tres pasos para la interacción entre la proteína y el coenzima. Durante el proceso, el bucle conservado 261-269 sufre una serie de cambios conformacionales para acomodar a las regiones PPi y NMN del cofactor tras un primer acoplamiento por la región 2¿P-AMP. Este proceso secuencial garantiza la selectividad de NADP+/H frente a NAD+/H ya que la entrada de la porción NMN del cofactor queda condicionada a un previo reconocimiento por el 2¿fosfato.
La implicación del residuo Leu263 en la unión productiva del coenzima se ha analizado aquí en la variante L268V de la enzima de guisante. La caracterización del proceso de TH no mostró cambios ni en la geometría del sitio activo, ni en el mecanismo de transferencia. Tampoco se habían observado alteraciones en estado estacionario o en los procesos de unión a nucleótido. Un mutante previo de AnFNR, L263P, sí que produjo una disminución de la eficiencia catalítica (Tejero et al. 2003). Estas observaciones llevan a la conclusión de que el factor determinante para una buena acomodación del coenzima es que la cadena principal de Leu263 tenga una buena movilidad, independientemente del volumen de la cadena lateral que tiene que ser desplazada. Así mismo, esas observaciones se relacionan con la preferencia por mostrar una prolina en esa posición en enzimas NAD-dependientes, ya que en ellas la cavidad de unión a NAD+ está preformada y no es necesaria ninguna reorganización posterior. Llamativamente, es precisamente una Pro el residuo que se encuentra en la posición equivalente a Leu263 en Leptospira y esa, junto con la presencia de una histidina en PfFNR, constituye la única excepción en la conservación de ese residuo descrita en FNRs plastídicas. Las estructuras cristalográficas obtenidas para LiFNR, tanto libre como en complejo con NADP+, muestran una posición idéntica del bucle tras la unión, por lo que en esta enzima no es necesaria una remodelación de esa zona para acomodar al coenzima, y la presencia de una prolina está justificada. No es descartable que la rigidez del bucle le pueda incluso conferir alguna ventaja en su especificidad por el nucleótido evitando una apertura del sitio de unión que podría favorecer la entrada de NAD+. Aun así, la selectividad de LiFNR por la forma fosforilada del coenzima es comparable a la del resto de enzimas plastídicas, lo que apunta a que son otras regiones del módulo de unión las que condicionan la especificidad en L. interrogans. Esas regiones podrían constituir factores relevantes para el proceso de discriminación llevado a cabo por FNRs fotosintéticas no detectados hasta el momento, por lo que los estudios de especificidad por el coenzima en LiFNR se presentan como sumamente interesantes.
En FPRs bacterianas tampoco se producen movimientos tan notables en las zonas de unión a nucleótido. Además, aunque el reconocimiento también sucede por el 2¿fosfato, la afinidad de unión por el homólogo 2¿P-AMP frente al nucleótido completo NADP+ no es tan marcada como en FNRs plastídicas (lo que indica un efecto negativo causado por la presencia de la nicotinamida). De hecho, en RcFPR la afinidad por ambos análogos es parecida, y en EcFPR es aún menor, y se ha relacionado con el efecto inhibitorio por NADP+/H observado en las reacciones de TH. RcFPR presenta una baja afinidad por el coenzima que se traduce en un valor de KdNADP+ muy elevado, y una dependencia creciente de kobs respecto a la concentración de nucleótido en las reacciones de TH (Nogués et al. 2005; Bortolotti et al. 2009). Esa dependencia sin embargo no se observó para las FPRs de X. axonopodis y E. coli, que presentan extensiones C-terminal más cortas que en RcFPR. Estas observaciones apuntan a la extensión de 6 residuos de RcFPR como la principal causa de la baja afinidad por NADP+, lo que se confirmó al ver como ésta aumentaba en los mutantes con modificaciones en el extremo carboxilo.
Para acomodar a la porción NMN, la cadena lateral aromática del residuo Tyr terminal en FNRs, o la extensión C-terminal en FPRs debe desplazarse de su posición enfrentada a la isoaloxacina. En este desplazamiento participan varios factores, y a pesar que todavía se desconoce el mecanismo completo que lo regula, los resultados experimentales, junto con la información extraída a partir de nuevas estructuras cristalográficas han permitido establecer algunos de ellos. Por un lado, el grupo fenilo de Tyr303 en AnFNR se encuentra formando una red de puentes de hidrógeno con Ser80 y Glu301 a través de moléculas de agua en el sitio activo. La eliminación del grupo hidroxilo en el mutante Y303F facilita la salida de su cadena lateral del sitio activo ya que ha perdido esas conexiones que lo fijaban en una posición enfrentada a la isoaloxacina, resultando en un mayor valor de kHT. Por otro lado, el grupo carboxilo terminal forma un puente de hidrógeno con la cadena principal de Arg264, que se rompe durante el desplazamiento del bucle 261-269 para volver a establecerse en el complejo catalítico final. Estudios recientes de DM señalaban esta interacción como clave para modular el desplazamiento de Tyr303, apuntando además a una posible modulación por efecto de los residuos Glu267 y/o Glu268 (Peregrina et al. 2012). Con objeto de comprobar esa hipótesis se diseñó y produjo un mutante doble E267A/E268M. Nuestros resultados no han podido concluir un papel relevante para la interacción por cargas entre Arg264 y Glu267, Glu268 en la regulación del movimiento de Tyr303. Sin embargo, se sugieren un papel modulador de Glu267 tanto en el proceso de unión a nucleótido como en la disposición final del complejo catalítico a través de interacciones con Thr302. En el caso de RcFPR, debe desplazarse la extensión terminal de 7 aminoácidos para permitir el acceso a la nicotinamida. La eliminación de esa extensión favorece la unión del nucleótido, pero no la catálisis, lo que lleva a la conclusión de que a pesar de que su presencia dificulta la formación de un complejo con NADPH, es necesaria para llevar a los anillos reactantes a una geometría final adecuada para que se produzca la TH y catálisis.
3.2. Geometría de los sitios activos La reacción de TH entre FNR y NADP+/H en ambas direcciones sucede a través de la formación de dos complejos transitorios de transferencia de carga entre los anillos reactantes, como también se ha observado en otras flavoproteínas (Tejero et al. 2007). Se había propuesto por tanto que la formación de estas especies intermedias era un requisito para que se produjera la TH de forma eficiente. Sin embargo, nuestros datos experimentales en las FNRs de Anabaena y guisante, así como el análisis de reacción entre NADPH y FPRs bacterianas, han demostrado que no existe una correlación clara entre estabilización de CTCs, y el valor de kHT. Por el contrario, parece que la formación de estas especies es consecuencia de la particular disposición de los anillos de isoaloxacina y nicotinamida en el sitio activo, tanto en distancia como en ángulo. Queda por tanto puesta en tela de juicio la relevancia fisiológica de los CTCs durante el proceso de catálisis. Además, cuando la reacción tiene lugar en el complejo ternario con Fd, su formación no se ha detectado, lo que puede ser consecuencia de una rápida disociación, o porque no lleguen a formarse. A pesar de la posible no implicación fisiológica de los CTCs en la catálisis, su aparición es muy dependiente de la geometría concreta del sitio activo, por lo que su detección en las reacciones de TH entre FNR y piridín nucleótido resulta una herramienta muy potente a la hora de evaluar similitudes y diferencias en la conformación espacial final de los anillos reactantes.
La formación de especies intermedias para PsFNR resultó muy similar a la de otras fotosintéticas caracterizadas, incluida AnFNR. Sin embargo, mientras que estas estabilizan tanto CTC-1 como CTC-2, EcFPR (de clase II) sólo estabilizó CTC-1, y para XaFPR (de clase I) solo se detectó espectro correspondiente a CTC-2. De forma similar, la caracterización de RcFPR también había mostrado una mayor estabilización de CTC-2 frente a CTC-1 que la mostrada para enzimas fotosintéticas (Bortolotti et al. 2009). Parece que en este hecho interviene la naturaleza de la cadena lateral que se sitúa en la cara re de la nicotinamida en el complejo catalítico, ya sea de tipo aromático o alifático. Además, la presencia de un anillo de indol en el entorno del anillo de flavina parece ser un factor desestabilizante de la formación de un complejo [FNRhq:NADP+], ya que tanto en EcFPR, como en el mutante Y303W de AnFNR no se observa formación de CTC-2.
Además, el análisis del resto de variantes de AnFNR y PsFNR estudiadas, junto con resultados previos de otros mutantes, ha revelado que en esa geometría final intervienen no sólo residuos directamente implicados en la unión de la nicotinamida y la isoaloxacina, sino también otras zonas más alejadas de la proteína, como Arg100 en AnFNR. No obstante, las regiones que tienen efectos más marcados tras su mutación son aquellos residuos conservados que se encuentran flanqueando el anillo de nicotinamida en el sitio activo. Concretamente mutaciones en el residuo aromático Tyr terminal y cambios en el volumen de la cadena lateral de Cys266 de PsFNR tienen un gran efecto en la geometría final del complejo.
3.3. El origen del protón Durante el proceso de TE y reducción de la flavina, el átomo N5i debe captar/ceder el protón que posteriormente será intercambiado con el NADP+/H en forma de hidruro. Diversos estudios de mutagénesis dirigida, así como el cálculo de probabilidades de protonación en las FNRs de Anabaena, espinaca y maíz sugieren que el residuo Glu301 (numeración de AnFNR), altamente conservado, debe ser la fuente de ese protón, captándolo del medio y cediéndoselo a N5i de la flavina en la reacción fotosintética (Aliverti et al. 1998; Medina et al. 1998; Dumit et al. 2010). En el caso de AnFNR, este papel del residuo Glu301 se ha visto reforzado tras la determinación de estructuras cristalográficas que muestran su cadena lateral orientada en diferentes conformaciones hacia Ser80 y N5i. La estructura de la variante Y303F ha mostrado la posición más expuesta determinada hasta la fecha, con la cadena lateral completamente orientada hacia el solvente. En RcFPR el residuo equivalente a Glu301, Glu264, también actúa como aceptor de protón fisiológicamente. Al contrario de lo observado para la FNR de maíz, a pH fisiológico su cadena lateral está protonada, y perdería el protón tras la unión de NADP+/H como señala la disminución de su valor de pKa (Dumit et al. 2013). El análisis mediante calorimetría de titulación isoterma llevado a cabo con las proteínas de RcFPR señalan a Glu270 como aceptor de ese protón en el proceso de unión RcFPR:NADP+. El estado de protonación de ese glutámico también se apunta como producto de la evolución de FNRs que trabajan en distintas direcciones, favoreciendo la entrada de NADP+ al sitio activo en FNRs fotosintéticas de plantas superiores, en las que se encuentra desprotonado (Dumit et al. 2010; Dumit et al. 2013).
3.4. Dinámica de los sitios activos El análisis comparativo de la reacciones de transferencia de hidruro y deuteruro en AnFNR ha demostrado que, al igual que sucede en otras reacciones de TH biológicas, la reacción entre FNR y NADP+/H tiene lugar con una gran contribución de efecto túnel. La misma conclusión se extrajo del estudio en los sistemas de guisante, X. axonopodis y E. coli. Esto ha hecho posible analizar los comportamientos dinámicos de los sitios activos de estas proteínas desde el marco teórico del ¿modelo de túnel acoplado al entorno¿ (Knapp and Klinman 2002). En las THs biológicas se han observado dos tipos de movimientos dinámicos de los sitios activos acopladas a la transferencia: dinámicas pasivas (reorganización ambiental) y dinámicas activas (muestreo de la distancia donador-aceptor o ¿gating¿) (Klinman 2013). Las primeras suceden por movimientos de los átomos pesados que conforman el sitio activo, mientras que las segundas se deben a fluctuaciones vibracionales de los átomos transferidos y constituyen la mayor fuente de dependencia del KIE con la temperatura. Estudios en proteínas de diversos orígenes han mostrado una tendencia de las enzimas a minimizar las dinámicas de ¿gating¿, lo que da lugar a KIEs que casi no varían con la temperatura. En cambio, perturbaciones de sus sitios activos bien mediante mutaciones, o bien llevándolas a condiciones catalíticas no óptimas resultan en una mayor contribución de fluctuaciones vibraciones de los átomos donador y aceptor (Basran et al. 2003; Nagel et al. 2012).
Las reacciones aquí estudiadas están de acuerdo con estas observaciones en el sentido de que las FPRs bacterianas, las más antiguas, carecen de contribución de ¿gating¿ a la TH. En cambio, las variantes plastídicas de Anabaena y guisante sí que dependen de modulaciones de la distancia donador-aceptor para alcanzar una disposición entre los átomos reactantes óptima para el túnel. La conclusión que se extrae de estos resultados es que la minimización de la flexibilidad vibracional de los sitios activos de las enzimas constituye un mecanismo de optimización tardío, que en el caso de las FPRs se ha podido conseguir ya que alcanzaron antes unos valores de kHT y eficiencia catalítica adecuados para los procesos que catalizan. Por el contrario, las exigencias de velocidad derivadas del proceso fotosintético, probablemente obligaron a las FNRs a dirigir su evolución desde la proteína ancestral hacia la mejora de sus tasas de recambio y TH, sacrificando la minimización de ¿gating¿.
Las perturbaciones causadas por efecto de sustituciones en el entorno del sitio activo de AnFNR y PsFNR mostraron tener distinto alcance en las consecuencias dinámicas acopladas a la TH. Mutaciones en residuos clave como Ser80 provocaron alteraciones en la geometría de los sitios activos llevando a los mismos a necesitar una mayor contribución de fluctuaciones vibracionales para alcanzar distancias óptimas entre los átomos donador y aceptor. En cambio, otras sustituciones disminuyeron la contribución de ¿gating¿ por dos motivos distintos: 1) favoreciendo un mejor acoplamiento de la nicotinamida en el sitio activo asociado con distancias N5i-C4n óptimas para el túnel como en Y303S y Y303W o 2) generando sitios activos muy rígidos con frecuencias de ¿gating¿ elevadas como lo observado tras el reemplazamiento de Cys266 en PsFNR.
4. Evolución catalítica de las FNRs de tipo planta Nuestros resultados, junto con la gran cantidad de información acumulada hasta la fecha sobre FNRs de tipo planta, muestran que la evolución de esta familia de reductasas desde una proteína ancestral ha estado dirigida y condicionada por las funciones fisiológicas que debe desempeñar cada una de las variantes dentro de la célula. Esa optimización es múltiple, y hay muchos factores que condicionan la fina regulación de propiedades de óxido reducción, flexibilidad, interacción con los sustratos y velocidades de TE y TH. Se trata por tanto de un proceso global de evolución, en el que las propiedades mencionadas anteriormente han alcanzado un compromiso que garantiza la obtención de la reductasa más apropiada en cada caso. De esta forma, facilitar el proceso de unión a nucleótido mediante la eliminación del residuo Tyr terminal en FNRs o del extremo carboxilo terminal en FPRs se ha comprobado que tiene consecuencias negativas en pérdida de especificidad por NADP+, o en un peor acoplamiento entre anillos reactantes. Adicionalmente, y a pesar de que el proceso de TH en FNRs fotosintéticas constituye un modelo de eficiencia, se han caracterizado dos mutantes con mayores tasas de kHT y kcat que AnFNR: S59A y Y303F. No obstante, en la reacción global de catálisis encontraban otros impedimentos que les impedían actuar con los sustratos Fd y NADPH de forma competente. La selectividad NADP/NAD se mantiene en todas las FNRs de tipo planta gracias a un preciso mecanismo de reconocimiento. Sin embargo, la accesibilidad de la nicotinamida en su estado oxidado al sitio activo es diferente en FNRs que catalizan mayoritariamente el proceso fotosintético con respecto a las que utilizan NADPH como fuente de electrones para otras proteínas. Dentro de las FNRs plastídicas, los cambios encontrados en la secuencia y movilidad del bucle 261-269, y la diferente protonación de Glu301 en el sitio activo parecen responder a un mecanismo de adaptación a las funciones biológicas que desempeñan.
Por último, cabe destacar las potenciales aplicaciones biotecnológicas y farmacológicas derivadas del estudio de esta familia de enzimas. La organización bi-dominio de las FNRs de tipo planta constituye un prototipo estructural que se encuentra formando parte de reductasas como CP450R, NAD(P)H oxidasa, metionina sintasa reductasa (MSR) u óxido nítrico sintasa (NOS). Estas proteínas están involucradas en importantes rutas biológicas eucariotas, y defectos en las mismas se asocian a diversas patologías. Por tanto, la comprensión de los detalles moleculares que controlan la reacción catalizada por FNRs es extrapolable a otras proteínas con potencial uso industrial y terapéutico. Dentro de las FNRs de tipo planta, la relevancia del estudio en la variantes de organismos patógenos como L. interrogans es indudable debido a su elevado valor como diana farmacológica. Más allá de estas aplicaciones, y dada su alta eficiencia catalítica a pesar de la baja homología de secuencia que comparte con el resto de FNRs plastídicas, su investigación se propone crucial para ampliar la comprensión de los factores que controlan la selectividad y eficiencia catalítica en las FNRs fotosintéticas, que a pesar de haber sido objeto de exhaustivo estudio durante los últimos 30 años, todavía presentan muchas cuestiones clave sin resolver.
