Resumen de Phop regulon characterization and its implication in protein secretion in mycobacterium tuberculosis. New vaccine construction based on phop mutant
En un primer objetivo nos propusimos estudiar el regulón de PhoP de Mycobacterium tuberculosis. El regulón de PhoP ha sido extensamente estudiado utilizando aproximaciones basadas en microarrays, DNA footprinting o gel shift. En este estudio se han utilizado nuevas técnicas de análisis global como RNA-seq, ChIP-seq y proteómica mediante espectrometría de masas, de forma conjunta para analizar en profundidad el regulón de PhoP, permitiendo descubrir nuevos aspectos del mismo no descritos anteriormente.
Los resultados de ChIP-seq de PhoP presentan una lista de 35 regiones del genoma de M. tuberculosis que combinados con los resultados de RNA-seq de las cepas H37Rv y el mutante phoP en diferentes condiciones (tanto en cultivo como infectando líneas celulares de macrófago alveolar de ratón, MH-S) dan lugar a una lista de 12 genes a los que PhoP se une regulándolos en todas las condiciones estudiadas. El gen más fuertemente regulado y al que se une más PhoP es mcr7, un RNA no codificante (ncRNA) descrito anteriormente. Se trata de un ncRNA propio del complejo tuberculosis que presenta una posible interacción con el mRNA de TatC, un gen esencial en M. tuberculosis que codifica para una proteína del complejo Tat de secreción de proteínas. Para estudiar las posibles implicaciones de esta interacción en M. tuberculosis, se realizó un estudio proteómico cuantitativo por espectrometría de masas sobre la fracción secretada de proteínas; se observó un incremento en la fracción de proteínas secretadas por el sistema Tat en el mutante phoP respecto de H37Rv o la cepa de phoP complementado.
Para confirmar el papel jugado por Mcr7 en la regulación del sistema Tat, se construyó una cepa de complementación de mcr7 sobre una cepa mutante phoP, restaurando el fenotipo TatC dependiente a niveles de la cepa salvaje, H37Rv.
En un segungo objetivo hemos estudiado la implicación de PhoP en la diferente expresión y secreción del factor de virulencia ESAT-6, dependiendo del tipo de cepa estudiada, H37Rv (cepa de referencia de laboratorio) por un lado y Mt103 y GC1237 (aislados clínicos) por otro.
Estudios previos mediante microarray de las cepas H37Rv y la cepa de aislado clínico Mt103 con sus respectivos mutantes phoP isogénicos demostraron una regulación diferencial sobre el factor de trascripción whiB6 dependiendo de la cepa usada, en Mt103 está actuando como activador sobre whiB6 mientras que en H37Rv está actuando como represor. Publicaciones anteriores relacionaban whiB6 con la regulación del sistema de secreción ESX-1, sistema por el cual es secretados Esat6. Estudiando en profundidad el perfil de expresión de este sistema en aislados clínicos, comparados con H37Rv, se observo la misma tendencia en regulación diferencial, en genes del sistema ESX-1, observada en whiB6. Los estudios comparativos de los niveles de producción y secreción de ESAT-6 entre aislados clínicos y H37Rv confirmo los resultados obtenidos en la expresión de genes.
Se estudiaron las secuencias de whiB6 y de su promotor en 76 aislados clínicos pertenecientes a 5 linajes diferentes de M. tuberculosis, así como de las cepas incluidas en la base de datos del NCBI. Estas secuencias revelaron la presencia de una mutación en el promotor de whiB6 presente únicamente en H37Rv y en su derivado H37Ra. Con el fin de demostrar que la mutación en el promotor de whiB6 provocaba la diferencia de los fenotipos observados se construyeron cepas de H37Rv y H37Rv phoP- donde se introdujo una copia de whiB6 con el promotor mutado de H37Rv o con el promotor sin mutación de Mt103. La producción y secreción de Esat6 en la cepa H37Rv con whiB6 bajo la influencia de promotor no mutado era similar a la producción y secreción en la cepa clínica Mt103.
En un tercer objetivo nos propusimos introducir una mutación adicional por delección en el candidato de cepa vacunal MTBVAC (mutante vivo atenuado con delecciones en phoP y fadD26), con el fin de híper-atenuar la cepa manteniendo la protección frente a la infección de M. tuberculosis para su potencial uso en individuos con riesgo de inmunosupresión, para los cuales la actual vacuna BCG está contraindicada. El gen deleccionado es Rv3810 (erp) utilizando una estrategia de doble recombinación obteniéndose una cepa triple mutante en phoP, fadD26 y erp. En modelo de ratones inmunodeprimidos SCID, se estudió la seguridad de esta cepa mostrándose más segura que la cepa vacunal actual BCG. Por último ensayos de protección frente a una infección de M. tuberculosis mostraron que el tripe mutante protegía frente a la infección.
